Баллы на мтс активировать: Как активировать бонусы на МТС в личном кабинете

Содержание

Как активировать бонусы на МТС в личном кабинете

Мобильный оператор МТС дает возможность абонентам получать вознаграждение за активное использование связи. Начисляется вознаграждение в виде бонусов, за которые можно приобретать разные пакеты услуг и дополнительные опции. В процессе использования мобильной связи абонент накапливает бонусные баллы и, накопив определенное количество средств, у него может возникнуть вопрос как активировать бонусы на МТС. Осуществить активацию возможно разными способами, но удобнее и быстрее всего выполнить этот процесс можно воспользовавшись личным кабинетом.

Активация бонусов на МТС

Для активации накопившихся бонусов абоненту необходимо зайти в персональный кабинет на официальном сайте компании и перейти в раздел «МТС Бонус». Там он найдет вкладку «как потратить баллы», в этом разделе представлен каталог вознаграждений, которые возможно приобрести за имеющиеся бонусы. Это могут быть минуты на звонки и бесплатные сообщения, сертификаты на совершение покупок, различные услуги, интернет-трафик и не только.

Если абонент интересуется как активировать бонусы на МТС на интернет, тогда он может обменять накопившиеся баллы на бесплатный трафик. Если он хочет потратить баллы на мобильную связь, тогда нужно перейти в раздел «Звонки, смс и ммс-сообщения».

Выбрав оптимальный вариант обмена бонусов, абонент должен перейти в нужный раздел и изучить условия обмена. Для покупки вознаграждения требуется определенное количество баллов, поэтому перед тем, как активировать бонусы на МТС с телефона или персонального кабинета нужно убедиться в том, что их хватить на выполнение операции. Выбрав конкретное вознаграждение и убедившись, что имеющихся баллов достаточно для его приобретения абоненту нужно отправить его в корзину, кликнув на соответствующий значок возле опции.

Другие варианты активации бонусов

Если у человека нет доступа к интернету, и он хочет активировать бонусы МТС через телефон, то это можно сделать, позвонив в абонентский отдел или с помощью USSD-запроса. Активировать бонусные баллы можно позвонив на бесплатный номер 0890 или лично обратившись в сервисный центр. Что касается USSD-запроса, то узнать нужную комбинацию возможно в личном кабинете или у оператора. Поэтому если человек хочет быстро узнать, как активировать бонусы на МТС на деньги, тогда вначале он должен найти нужную комбинацию.

Вопрос как активировать бонусы на минуты с МТС является не единственным, интересующим абонентов сети, также они часто узнают, как осуществить передачу баллов другому абоненту. Перечислить часть имеющихся на бонусном счету баллов другому абоненту возможно с личного кабинета или с помощью оператора.

на деньги, интернет трафик, минуты, звонки и смс

Мобильный оператор МТС предоставляет для своих абонентов действующую бонусную программу, которая предусматривает накопление баллов. Их можно тратить на определенные товары и оплачивать услуги. Это достаточно удобно, так как можно в стандартном режиме пользоваться сотовой связью, получая баллы и экономя свои личные средства. Как активировать баллы на МТС?

Как активировать баллы на МТС на деньги на телефон


Не каждый абонент знает о подключении услуги МТС-бонус баллы накапливаются без его ведома. Проверить свой бонусный счет можно на официальном сайте компании, через мобильное приложение или же у оператора компании.

Для того чтобы пройти процедуру активации следует выбрать один из представленных вариантов:

  • Личный кабинет на официальном сайте.
  • Мобильное приложение.
  • Сервисные центры компании.
  • USSD-запросы.

Проводить операцию следует правильно. В противном случае могут возникнуть непредвиденные обстоятельства, например приобретение не той услуги, которая была необходима. В таком случае возврат не производится. Подобные действия не предусмотрены внутренней политикой компании.

Рекомендации по активации

Как активировать бонусы на МТС с телефона или компьютера правильно? Для этого нужно предварительно ознакомиться с перечнем предоставляемых услуг:

  1. На звонки внутри сети (50-300 мин.).
  2. На минуты другим операторам России (25-100 мин.).
  3. На СМС-сообщения (25-100 шт.).
  4. На ММС-сообщения (10-50 шт.).
  5. На интернет-трафик (500 Мб).

Обратите внимание, что бонусная программа постоянно корректируется. Именно поэтому, для получения актуальной информации следует предварительно обратиться к оператору или же посетить соответствующий раздел официального сайта компании.

Можно ли поменять баллы на деньги? Такой возможности абонентам сотовая сеть не предоставляет. Это нужно для исключения вероятность конвертирования баллов в реальные денежные средства для вывода со счета.

Как активировать баллы на интернет на МТС

Для того чтобы активировать баллы на интернет трафик следует предварительно ознакомиться с пошаговым руководством. Услуга подключена для всех абонентов без исключения, что не требует проведения никаких дополнительных действий. Получается, что и накопление баллов происходит в свободном режиме для всех пользователей системы.

Происходит данный процесс следующим образом:

  • При расходовании баланса на звонки.
  • При отправке СМС-сообщений различного типа.
  • При использовании мобильного интернета.
  • При оплате товаров и услуг посредством мобильного оператора.

Для активации можно воспользоваться любым из представленных выше способов. Среди наиболее востребованных вариантов следует выделить USSD-запрос и личный кабинет в системе. Для подключения интернета за бонусы нужно набрать номер 4555 или ввести запрос *111*455*1#.

Как активировать бонусы на МТС на минуты и СМС

Каждый абонент должен перед активацией баллов предварительно внимательно изучить перечень действий. Это исключает вероятность появления ошибочных процедур. Если же ошибка все же произошла, то исправить ее не представляется возможным.

Для проведения процедуры можно отправить пустое сообщение на короткий номер 4555 или же ввести USSD-запрос *100*2#. После того, как действие будет совершено, абоненту будет выслано уведомление о совершенном действии.

Дополнительные сведения


Многие абоненты все же ухищряются на то, чтобы подзаработать на бонусной программе путем передачи СИМ-карты другому лицу. Обратите внимание, что данный вариант не выгоден тем, что стоимость такой услуги очень низкая, и не каждый согласится на подобную манипуляцию, потому что риски мошенничества очень велики.

Лучше использовать бонусные баллы для подключения услуг.

Приобретения товаров или переводя на счет других абонентов. Для этого абоненту нужно войти в личный кабинет через официальный сайт компании в соответствующий раздел «Каталог вознаграждений». Здесь представлены не только услуги МТС, но также сертификаты, развлечения, журналы и мобильные телефоны. После добавления нужного товара в корзину, его можно оплатить не деньгами, а накопленными баллами.

Заключение

Если при использовании услуги возникли вопросы информационного или технического плана, то можно обратиться в сервисный центр компании или же связаться с оператором колл-центра по телефону 0890. Обратите внимание, что в целях повышения качества обслуживания разговор с клиентом записывается.

МТС – российский сотовый оператор, предоставляющий услуги высокого качества. Мобильный провайдер предоставляет максимально выгодные условия для сотрудничества. Среди наиболее востребованного сервиса следует выделить МТС-бонус.

Как подключить бонус на МТС

Абоненты оператора МТС постоянно оставляют позитивные отзывы об улучшении сервиса. Помимо основных услуг мобильной связи, домашнего интернета, телевидения, компания активно продвигает качественные дополнительные сервисы, предоставляющие пользователям определенные преимущества.

Программа лояльности «Bonus.MTS» считается главным достижением оператора за последние несколько лет, поскольку за счет нее удалось привлечь несколько сотен тысяч новых клиентов. Первым этапом в работе с сервисом является регистрация. Разобраться, как подключить бонусы МТС, может каждый пользователь не зависимо от используемого устройства

Как подключается «МТС Бонус»

Подключать личный кабинет к бонусной программе рекомендуется с персонального компьютера, поскольку такая процедура позволяет сразу получить несколько дополнительных баллов. При этом больше методов регистрации доступно на мобильных девайсах, включая как смартфоны, так и устаревшие кнопочные телефоны

Способов, как стать участником программы лояльности, несколько. Главным условием является использование услуг мобильной связи или услуги домашние ТВ/интернета. Кроме того, в некоторых методах рекомендуется заранее создать личный кабинет на основном портале МТС, чтобы ускорить процесс авторизации в бонусной системе.

Абонентам мобильной связи для этого потребуется:

  1. Открыть главную страницу официального портала.
  2. Нажать кнопку «Войти» в правом верхнем углу, затем – «Мобильная связь».
  3. Выбрать пункт «Получить пароль по SMS».
  4. Указать номер телефона без «восьмерки», ввести проверочные символы.
  5. Ввести полученный по SMS одноразовый пароль.
  6. Создать собственный постоянный пароль.

Пользователям домашнего интернета и телевидения придется воспользоваться более сложной схемой, поскольку для подключения личного кабинета требуются сведения, указанные в договоре об оказании соответствующих услуг.

Зарегистрироваться необходимо в следующем порядке:

  1. Нажать «Войти», затем – «Домашний интернет и ТВ».
  2. Перейти к пункту «Зарегистрировать».
  3. В графе «Юридический статус» выбрать «Частное лицо».
  4. Заполнить анкету с паспортными данными (все поля обязательны).
  5. Нажать кнопку «Зарегистрироваться».
  6. Создать логин, пароль, привязать электронную почту или телефон.
  7. Подтвердить регистрацию через SMS или письмо на e-mail.

Личный кабинет в дальнейшем позволит проходить быструю авторизацию на портале «Бонус МТС». Кроме того, пользовательский раздел помогает работать с иными опциями и полностью управлять предоставляемыми оператором услугами

Способ подключения №1

Единый интернет-ресурс «MTS.Ru» включает множество порталов. Одним из крупнейших обособленных сайтов является «МТС Бонус», предоставляющий полный спектр возможностей по работе с программой лояльности оператора.

Подключиться с его помощью к сервису предельно просто:

  1. Открыть портал «Bonus.MTS».
  2. Нажать «Войти в Мой МТС Бонус».
  3. Перейти к одному из двух предложенных вариантов:
  • «Мобильная связь»;
  • «Домашний интернет и ТВ».
  1. Пройти авторизацию в личном кабинете МТС.
  2. Заполнить форму с электронной почтой, полом, знаменательной датой (например, день рождения или дата выпуска).
  3. Ознакомиться с Правилами участия в программе, нажать «Подключиться».
  4. Подтвердить учетную запись через письмо, отправленное на электронный ящик.

Проходить регистрацию в личном кабинете бонусной системы на официальном портале не только удобно, но и выгодно. После подтверждения почтового ящика сервис сразу предлагает заполнить дополнительную анкету, за которую пользователь может

получить 50 дополнительных баллов

Способ подключения №2

Мобильное приложение «Мой МТС» имеет порядка 20 миллионов установок на различных платформах. С его помощью абоненты управляют услугами оператора, подключают дополнительные опции. В число функций программы также входит регистрация в бонусной системе.

Для подключения к сервису после загрузки и установки приложения с «Play Маркет» или «App Store» потребуется:

  1. Запустить «Мой МТС», пройти авторизацию.
  2. Выбрать раздел «Бонусы», нажать кнопку «Подключить».
  3. Ввести адрес электронной почты.
  4. Изучить Правила участия, нажать «Подтвердить».
  5. Перейти по ссылке из приложения в электронную почту и подтвердить регистрацию.

Приложение доступно не для всех устройств. Устаревшие модели с прошивками до Android 4.1 и iOS 8.0 не поддерживают программу, поэтому для них придется использовать способы, рассмотренные ниже

Способ подключения №3

Смартфонам без подключения к интернету и кнопочным телефонам идеально подойдет вариант с быстрой регистрацией. Использовать для этого можно два инструмента: SMS-сервис и USSD-команду. Различия в данных способах только процедурные, поскольку результатом является вступление в программу лояльности без приветственных бонусов при возможности тратить накопленные баллы.

Процедура подключения через СМС требует:

  1. Запустить приложение для обмена SMS-сообщениями.
  2. Создать новую «СМСку», ввести в поле «Получатель» номер 4555.
  3. Указать в поле для ввода сообщения цифру 1, после чего отправить.

Использовать USSD-команду еще проще:

  1. Запустить приложение для совершения исходящих вызовов.
  2. Перейти к экрану ввода мобильных номеров.
  3. Указать USSD-код *111*455*1# и нажать кнопку вызова.

В обоих случаях в качестве подтверждения в течение минуты на телефон придет SMS с информацией о регистрации. Дополнительно в нем указывается, как активировать баллы на МТС и начать обменивать их на бонусы через портал «Bonus.MTS». При этом накапливаться бонусные рубли начинают вне зависимости от активации. Так же можно оплачивать бонусами  почти любой тариф от МТС.

Подключение к программе лояльности «МТС Бонус» допускается в нескольких вариациях. Каждый способ удобен по-своему в зависимости от используемого устройства. Первые два метода имеют более широкий функционал и позволяют непосредственно обменивать бонусы на призы, в то время как второй вариант предлагает быструю регистрацию, чтобы начать накопление баллов.

Как Получить Баллы в Мтс Бонус Бесплатно © ПромоКодез

Как использовать бонусы МТС

Оператора МТС справедливо называют одним из наиболее щедрых, так как в его арсенале то и дело появляются различные программы лояльности, последней из которых стала «МТС Бонус». Программа предусматривает накопление бонусных баллов за традиционные траты пользователя на мобильную связь. Бонусы от МТС являются весьма разнообразными, они представлены бесплатным подключением полезных услуг и опций, Как Получить Бонусы Мтс Бесплатно

Данная программа будет особенно интересна тем абонентам, которые тратят внушительные суммы на ежемесячное обеспечение мобильной связи и могут обменять баллы на выгодные вознаграждения.

Как подключить МТС Бонус

Потратить баллы МТС бонус могут лишь те пользователи, которые предварительно зарегистрировались в программе. Для активации бонусного накопления необходимо следовать оному из указанных способов:

  • посещение официального сайта МТС, где в соответствующем разделе необходимо заполнить анкету, после завершения на счет абонента поступает приветствующий бонус в размере 150 баллов. Те пользователи, которые укажут настоящую дату рождения и электронный адрес, будут начислены дополнительные 110 бонусов;
  • активация коротким запросом *105#;
  • отправка SMS-сообщения на номер 4555, сообщение может быть как пустым, так и содержать текст;
  • *111*455*1# — набор комбинации на телефоне;
  • регистрация при оформлении карты «МТС Деньги».

Как действует накопительная система баллов

После активации львиная доля расходов на мобильную связь будет перечисляться в баллы. Чем большее количество средств будет израсходовано на общение и прочие услуги от МТС, тем большее количество баллов будет зачислено на счет абонента.

Баллы накапливаются следующим образом:

  1. общение по SMS-сообщениям;
  2. отправка сообщений формата MMS;
  3. пользование мобильным интернетом;
  4. отправка голосовых вызовов;
  5. использование банковских карт для оплаты;
  6. оплата по услугам домашний интернет и домашнее телевидение;
  7. пополнение лицевого счета и покупка приложений;
  8. начисление бонусов за приглашение друзей.

Как потратить бонусы на услуги

Для того чтобы контролировать количество баллов и возможность их обмена, необходимо посещать раздел «Личный кабинет» на сайте МТС. Здесь абонент может увидеть количество накопленных балов. Для контроля над бонусами удаленно можно использовать следующие команды: *111*455*0# или отправка сообщения с цифрой «0» на номер 5010.

На странице сайта среди основных пунктов меню представлен раздел «как потратить бонусы». Вы можете выбрать один из интересующих пунктов и обменять баллы на:

  • бесплатные минуты общения – от 10 до 60 минут в день. МТС часто проводит акции на безграничное общение, предлагая купить пакет за сниженное количество бонусов;
  • пакеты бесплатных смс;
  • заказ определенного количества трафика;
  • Очки для социальных сетей. Средний обмен 100 Оков равняется 300 накопленным баллам;
  • знакомства МТС;
  • сертификаты и скидочные карты на покупку в реальных магазинах.

Последний вариант обмена бонусов имеет противоречивые плюсы и минусы. С одной стороны пользователи могут приобрести желанную вещь или модель мобильного телефона по существенной скидке в 50%. Минусом способа обмена является курс перевода скидки.
При переводе баллов в сертификат их стоимость составляет около 5 копеек за бонус.

Наибольшей популярностью пользуется обмен баллов на услуги связи – бесплатные минуты и смс. Стоимость 20 акционных сообщений равняется 90 баллам. Если Вы желаете приобрести 50 сообщений, то придется «опустошить» бонусный счет на 140 баллов.

Максимальным пакетом сообщений является 100 смс, которые обойдутся Вам в 190 баллов.

Для заказа выбранной категории обмена необходимо «положить» вознаграждение в корзину. В верхнем углу сайта расположена наполненная корзина, в которую необходимо зайти и подтвердить заказ обмена.

Что делать, если под рукой нет интернета

Осуществить обмен можно и с помощью коротких запросов с мобильного телефона. Для каждой конкретной услуги предусмотрен персональный код:

  • для получения интернет трафика необходимо отправить запрос *707*31# или сообщение с цифрой «31» на номер 7070. Услуга подключения интернета предоставляется на месяц, ее стоимость составляет 150 баллов;
  • для обмена бонусов на бесплатные разговоры внутри сети необходимо создать запрос *707*11# или отправить сообщение с цифрой «11» на номер 7070. Заказ пакета минут на месяц составит 75 баллов.

Как подарить МТС бонусы

Альтернативным способом использования бонусов является их перевод на номер друга. Использовать данный метод реализации бонусного счета следует в том случае, если ни один из предложенных вариантов обмена не заинтересовали пользователя, а его друг нуждается в дополнительном количестве балов для реализации вознаграждения. Отправить подарок можно следующими путями:

  1. отправка сообщения со словом «Дар» на номер 4555, при этом в сообщение указывается номер абонента, кому отправляются баллы, а так же их количество. Комбинация выглядит следующим образом: «ДАР 86708744425 200»;
  2. посещение ресурса «МТС Бонус», где необходимо заполнить соответствующую форму и параметры перевода.

Читатйте в статье:

Как активировать бонусы на МТС

Оператор мобильной связи мтс предлагает своим абонентам бонусную программу, по которой накапливаются баллы мтс. Это удобно, поскольку можно просто использовать связь в стандартном режиме, получая за это баллы, а как результат потом данные баллы менять на другие мобильные услуги или подарки.

Но у многих возникает вопрос, как активировать бонусы на мтс. Поскольку некоторые просто не знали что у них на сим-карте работает система «МТС-бонус», а после того как узнали о ней сразу хотят использовать бонусные баллы.

Чтобы можно было потратить бонусы мтс, абонентам следует воспользоваться:

  1. Персональным кабинетом на сайте компании, где можно подобрать нужную услугу за баллы.
  2. Использовать мобильное приложение, которое позволяет тратить бонусы с телефона.
  3. Обратиться за помощью к работникам компании в фирменных магазинах мтс.
  4. Также абоненты могут узнать на сайте компании специальные сервисные комбинации, после ввода которых, спишутся баллы и включится опция, согласно введенному запросу.

Вот и все методы как активировать баллы на мтс различными методами.

Но также следует знать, как правильно потратить активированный пакет бонусов. Для этого компания мтс предлагает исчерпать их на:

  1. Пакеты бесплатных минут для разговоров внутри сети, с разными объемами от 50 до 300 минут.
  2. Пакеты бесплатных минут для разговоров с абонентами, которые используют услуги мобильной связи других операторов России. Объем может быть от 25 до 100 минут.
  3. Предоставляются также опции, благодаря которым можно получить бесплатные текстовые сообщения для отправки по всей стране на любые мобильные операторы, объем смс-сообщений составляет от 25 до 100 штук.
  4. Также можно потратить бонусы на приобретение бесплатных ммс-сообщений, которые тоже можно отправит по всей России инее только внутри сети, но и за ее пределами. Объем будет составлять от 10 до 50 ммс.
  5. Также клиенты могут потратить баллы для обмена на интернет-трафик, объемом от 50 до 500 Мб.

Кроме этого данные по пакетам с бонусами постоянно меняются и обновляются. В связи с чем, рекомендуется уточнять информацию перед тем, как активировать любой из них.

Подключение баллов

Активация такой бонусной программы от компании связи мтс происходит в абсолютно автоматическом режиме. Клиентам не потребуется самостоятельно подключать сервис, так как МТС-бонус уже активна на сим-карте. А как только симка попадает в мобильный телефон и абонент начинает использовать связь, то баллы накапливаются.

Накопление происходит по следующим параметрам:

  1. Если клиент пользуется исходящими вызовами;
  2. Накопление будет при отправке сообщений любого формата;
  3. Используется на мобильном телефоне интернет;
  4. Если клиент делает покупки через банковские карты, то баллы также зарабатываются.

Если случилось так, что бонусная программа на телефоне не работает и по каким-либо причинам отключена, то клиенты могут ее подключить. Для этого можно выбрать любой метод активации:

  1. Можно использовать личный кабинет и через него заполнить специальную форму на получение бонусов.
  2. Можно активировать программу через мобильный телефон. Для этого следует отправить бесплатное сообщение по телефону 4555. При этом само сообщение может быть пустым или с произвольным текстом.
  3. Самым удобным методом подключения является использование сервисной комбинации. Чтобы включить программу с баллами нужно ввести на устройстве *111*455*1#.

Как активировать баллы на МТС?

Компания сотовой связи МТС начисляет своим абонентам бонусные баллы просто за то, что люди пользуются данной сетью. Эти поощрения постепенно накапливаются, и со временем появляется возможность обменять их на какие-либо вознаграждения.

    Инструкция
  • Для того чтобы обменять бонусные баллы на какие-либо вознаграждения в сети «МТС», войдите на официальный сайт компании. В раскрывающемся списке выберите свой регион и перейдите по ссылке «МТС-Бонус». На появившейся странице выберите раздел «Как потратить баллы».
  • Авторизуйтесь в вашем личном кабинете на сайте МТС, добавив в предложенное поле свой номер телефона и пришедший на него в виде сообщения пароль.
  • Откройте каталог вознаграждений, содержащий следующие пункты: «Минуты», SMS, MMS, «Интернет», «Сертификаты», «Опции МТС», «Мобильные телефоны», «Развлечения» и «Журналы». Зайдите в любой заинтересовавший вас раздел и обратите внимание на содержащиеся в нем вознаграждения.
  • В зависимости от того, какое количество баллов вы имеете на своем счету, выберите понравившееся вам вознаграждение. Если вы активно пользуетесь различными услугами МТС, и у вас скопилось очень много баллов, их можно даже обменять на один из представленных в данной программе поощрений мобильных телефонов.
  • Чтобы произвести обмен баллов на нужное вам вознаграждение, кликните на значок «В корзину» рядом с выбранным пунктом. Кроме того, вы можете подарить свои баллы кому-либо. Для этого перейдите по ссылке «Подарить баллы» и введите номер телефона того абонента, которому вы хотите преподнести сюрприз.
  • Узнайте остаток бонусных минут, SMS, MMS, интернет-услуг, набрав следующий USSD-запрос: «*100*2#» и нажав кнопку вызова.
  • Если у вас нет доступа в интернет, чтобы активировать бонусные баллы в компании МТС, позвоните по круглосуточному бесплатному номеру справочно-информационной службы 0890 и следуйте инструкциям автоинформатора либо свяжитесь с дежурным оператором. Также можно обратиться в ближайший салон-представительство компании МТС, взяв с собой личный паспорт.
Оцените статью!

Как активировать баллы на МТС? — 4 info

  • Бонусные баллы МТС — полезная штука. Они начисляются просто за пользование связью МТС (за оплату своего счета, покупки в салонах МТС и пр.).

    Зарегистрироваться в «МТС-Бонус» можно в Личном Кабинете на сайте МТС

    (логин — ваш номер телефона, пароль для входа получаете по СМС). Жмите на «МТС-Бонус», заполните форму, после этого сразу начислят 100 баллов. В Личном Кабинете видно, сколько у вас бонусов, историю начислений, куда их можно потратить.

    Я обычно трачу свои бонусы на дополнительный пакет бесплатных СМС и на услугу «Везде, как дома».

    Еще удобнее управлять своими бонусами в мобильном приложении «Мой МТС» — буквально одним кликом.

  • Компания «МТС» предлагает свои клиентам заманчивую бонусную программу. Бонусы можно использовать на различные цели.

    Активировать бонусы МТС можно через официальный сайт, зайдя в приложение на телефоне или через компьютер.

    Также активация возможна при наборе комбинации 0890.

    В случае затруднений и вопросов всегда можно обратиться в офис МТС.

  • Для того что-бы активировать баллы сотового оператора МТС необходимо зарегистрироваться на сайте МТС, после этого вы сможете проверить свои накопленные баллы и приобрести что-либо на них, сделать это легко в разделе МТС бонус личного кабинета в нем представлены различные предложения по расходу баллов.

  • Активировать баллы легче всего на сайте МТС.

    Нужно зайти на МТС Бонус и выбрать: Как потратить баллы.

    Выбрать из предложенных вариантов:

    • Минуты , SMS, MMS,
    • Интернет,
    • Сертификаты,
    • Мобильные телефоны,
    • Развлечения и Журналы.

    В зависимости от баланса накопленных баллов можно выбрать то, что понравилось, а если баллов накопилось достаточно, то даже и мобильный телефон.

    Выбрать можно кликнув на значок: «В корзину».

    При отсутствии интернета, можно позвонить по телефону 0890 (автоинформатор) или связаться с оператором.

    Можно обратиться в любой из салонов МТС, но в этом случае, для активации баллов, попросят показать паспорт.

  • Активировать свои полученные баллы у оператора связи МТС вы сможете непосредственно в свом личном кабинете. Здесь у вас будет возможность увидеть и их полное накопившееся количество, а также и определиться с их тратой. щ можно активировать баллы при звонке оператору на 0890.

  • Бонусная программа МТС позволяет накапливать баллы, а затем использовать их для дополнительных звонков, СМС, доступа в Интернет и т.д. Программа работает для всех пользователей-физических лиц, бонусы начисляются автоматически, в зависимости от активности счета.

    Активировать баллы на МТС удобнее всего через сайт МТС, войдя в личный кабинет. Там же можно посмотреть, сколько баллов накопилось и выбрать на что потратить накопившиеся баллы.

    Чтобы активировать баллы на МТС через телефон, нужно набрать номер автоматического оператора МТС 0890 и дальше следовать голосовому меню.

  • Нужно быть зарегистрированным в программе МТС бонус, затем на официальной странице сайта авторизоваться, затем перейти по ссылке бонусных предложений и обменять бонусные баллы на интернет траффик или пакет смс или какие либо другие услуги от компании МТС.

  • Только что активизировал своих 60 балов на оплату части ежемесячного платежа за действующий тариф, позвонив по номеру 0890. Правда должно ждать ответа специалиста, в личном кабинете на сайте оператора МТС это быстрее.

  • Для того, чтобы активировать баллы на МТС необходимо позвонить по круглосуточному и бесплатному номеу 0890 и следовать инструкциям автоматического информатора. Или же свяжитесь оператором МТС.

    Также возможно обратиться в ближайший офис компании МТС, взяв с собой паспорт.

    О том, на что можно обменять баллы нужно иметь доступ в интернет. Для этого, войдите на официальный сайт сотового оператора МТС.

    Выбираем свой регион и переходим по ссылке МТС-Бонус . На новой странице выбираем раздел Как потратить баллы .

  • Вы накопили достаточно бонусных баллов и хотите их использовать: активировать баллы.

    Сделать это можно через ваш личный кабинет на сайте МТС.

    Заходите на официальный сайт МТС > переходите по ссылке в личный кабинет > авторизуетесь > в самом низу страницы есть своеобразное меню с отдельным разделом «МТС бонус» (тут вы можете посмотреть бонусный счет, каталог вознаграждений и тд).

    Переходите по второй ссылке — в «Каталог вознаграждений»:

    Далее во вкладку «Потратить баллы» (и выбрать раздел услуг, на которые хотите потратить бонусы):

    Сразу же можно тут и активировать услугу, используя свои баллы, простым нажатием и подтверждением действия.

  • Как активировать баллы на МТС? — 4 info

  • Бонусные баллы МТС — вещь полезная. Они начисляются просто за использование связи МТС (оплата счета, покупки в магазинах МТС и т. Д.).

    Зарегистрироваться в «МТС-Бонус» можно в Личном кабинете на сайте МТС

    (логин — ваш номер телефона, пароль для входа вы получаете по SMS). Нажмите на «МТС-Бонус», заполните форму, после чего сразу будет начислено 100 баллов. В Личном кабинете вы можете увидеть, сколько у вас бонусов, историю начислений, где вы можете их потратить.

    Обычно я трачу свои бонусы на дополнительный пакет бесплатных SMS и на услугу «Везде, дома».

    В мобильном приложении «Мой МТС» управлять своими бонусами стало еще удобнее — буквально в один клик.

  • Компания МТС предлагает своим клиентам заманчивую бонусную программу. Бонусы можно использовать для различных целей.

    Активировать бонусы МТС можно через официальный сайт, зайдя в приложение на телефоне или через компьютер.

    Также возможна активация по комбинации 0890.

    В случае затруднений и вопросов вы всегда можете обратиться в офис МТС.

  • Для того, чтобы активировать баллы мобильного оператора МТС, вам необходимо зарегистрироваться на сайте МТС, после чего вы сможете проверить свои накопленные баллы и что-то на них приобрести, это легко сделать в разделе бонусов МТС личного кабинета содержит различные предложения по потере баллов.

  • Активировать баллы проще всего на сайте МТС.

    Вам нужно зайти в МТС Бонус и выбрать: Как потратить баллы.

    Выберите из предложенных вариантов:

    • Минуты, SMS, MMS,
    • Интернет,
    • Сертификаты,
    • Мобильные телефоны,
    • Развлечения и журналы.

    В зависимости от баланса накопленных баллов вы можете выбрать то, что вам нравится, а если набралось достаточно баллов, то даже мобильный телефон.

    Вы можете выбрать, нажав на иконку: «В корзину».

    При отсутствии интернета можно позвонить по телефону 0890 (автоинформатор) или связаться с оператором.

    Вы можете обратиться в любой из салонов МТС, но в этом случае для активации баллов вас попросят предъявить паспорт.

  • Активировать полученные баллы у оператора связи МТС можно прямо в личном кабинете. Здесь у вас будет возможность увидеть их полную накопленную сумму, а также определить их расходы. y вы можете активировать баллы, позвонив оператору по номеру 0890.

  • Бонусная программа МТС позволяет накапливать баллы и затем использовать их для дополнительных звонков, SMS, доступа в Интернет и т. Д. Программа работает для всех индивидуальных пользователей, бонусы начисляются автоматически, в зависимости от активности аккаунта.

    Активировать баллы в МТС Удобнее всего через сайт МТС, войдя в личный кабинет. Там же вы можете увидеть, сколько очков накоплено, и выбрать, на что потратить накопленные очки.

    Для активации баллов на МТС по телефону необходимо набрать автоматический номер оператора МТС 0890 и далее следовать голосовому меню.

  • Вам необходимо зарегистрироваться в бонусной программе МТС, затем авторизоваться на странице официального сайта, затем перейти по ссылке бонусных предложений и обменять бонусные баллы на Интернет-трафик или пакет SMS или любые другие услуги от МТС.

  • Я только что активировал свои 60 баллов для оплаты части ежемесячного платежа по текущему тарифу, позвонив по телефону 0890.Правда стоит дождаться ответа специалиста, в личном кабинете на сайте оператора МТС быстрее.

  • Для активации точек в МТС необходимо позвонить по круглосуточному бесплатному номеру 0890 и следовать указаниям автоматического информатора. Или обратитесь к оператору МТС.

    Также можно обратиться в ближайший офис МТС, взяв с собой паспорт.

    По поводу того, на что можно обменять баллы, необходимо иметь доступ в Интернет.Для этого перейдите на официальный сайт мобильного оператора МТС.

    Выберите свой регион и перейдите по ссылке МТС-Бонус … На новой странице выберите раздел Как потратить баллы .

  • Вы накопили достаточно бонусных баллов и хотите их использовать: погасите баллы.

    Это можно сделать через личный кабинет на сайте МТС.

    Зайдите на официальный сайт МТС> перейдите по ссылке в личный кабинет> авторизуйтесь> в самом низу страницы есть своеобразное меню с отдельным разделом «Бонус МТС» (здесь вы можете увидеть бонусный счет, каталог наград и др.).

    Перейдите по второй ссылке — в «Каталог наград»:

    Затем перейдите на вкладку «Тратить баллы» (и выберите раздел услуг, на которые хотите потратить бонусы):

    Вы можете сразу активировать услугу здесь , используя свои баллы, просто щелкнув и подтвердив действие.

  • Плюс-концы микротрубочек действуют как центры передачи физических сигналов для активации RhoA во время цитокинеза

    Рецензент № 1:

    Верма и Мареска используют TIRF-визуализацию уплощенных делящихся клеток S2 для анализа распределения ключевых цитокинетических регуляторов.Они сообщают о визуализации MT плюс кончиков, украшенных центральным шпиндлином и ECT-2 и связанных с фокусами активации RhoA. Истощение EB1 предотвращает накопление этих факторов на концах микротрубочек и приводит к умеренному, но значительному снижению образования борозд дробления. Авторы идентифицируют область RacGAP50C, которая, как предполагается, опосредует его ассоциацию с EB1. Авторы предполагают, что эти комплексы плюс кончик представляют собой критические средства, с помощью которых активируется RhoA. Хотя многие аспекты этих наблюдений были ранее продемонстрированы (например,PMID 19720876, ссылки в пункте 5 ниже), это исследование связывает эти очаги с активацией RhoA на рисунке 2. Хотя это очень интересный результат, существует ряд существенных недостатков. Во-первых, неясно, в какой степени экспериментальная установка соответствует требованиям EB1. Кроме того, есть ряд основных моментов, которые требуют дополнительной документации и количественной оценки, дополнительных средств контроля. Есть также некоторые несоответствия с существующей литературой и другими местами, где цитаты отсутствуют или неуместны.

    Существенные изменения:

    1) В то время как визуализация TIRF обеспечивает исключительный обзор вентральной поверхности клетки, также важно визуализировать события на дорсальной поверхности и остальной части клетки. Чтобы сделать клетки более плоскими для визуализации TIRF, их прикрепляют к предметным стеклам, покрытым ConA. Хотя этот подход часто используется в контексте клеток S2, эта сильная адгезия и уплощение клеток могут изменить требования к сборке и проникновению сократительного кольца (например, см. PMID 27298323).

    Поэтому для обеспечения контекста авторы должны показать изображения делящихся клеток (+/- EB1) на слайдах ConA в режиме без TIRF, чтобы можно было оценить степень и скорость образования борозды и сравнить с клетками, которые не так высоки. сплющенный. Авторы должны также оценить, наблюдается ли потребность в EB1 при делении клеток также в клетках, которые не прикреплены к стеклу, покрытому ConA (для сравнения с результатами на фиг. 6C). Сходным образом, чтобы обеспечить положительный контроль над сильными дефектами цитокинеза, авторы должны исчерпать ортолог Cyk4 и оценить дефекты цитокинеза, как показано на Рисунке 6C, D.

    Спасибо, что подняли этот вопрос. Чтобы устранить озабоченность этого рецензента, мы провели несколько экспериментов и соответствующим образом изменили рукопись. Каждый из этих пунктов рассматривается ниже и помечен буквами A, B, C и D.

    A) Чтобы наблюдать локализацию кончика по направлению к дорсальной поверхности и остальной части клетки, мы выполнили конфокальную микроскопию с вращающимся диском клеток, экспрессирующих Dm, MKLP1-EGFP и Tag-RFP-α тубулин, включая клетки с эндогенным Dm. MKLP1 истощился (см. Пункт 11 ниже).Наше конфокальное изображение вращающегося диска Dm MKLP1-EGFP выявило положительную локализацию кончика не только на вентральной стороне клетки рядом с покровным стеклом, но также и на дорсальной стороне (до 4,8 мкм) и во всем объеме клетки. Теперь мы включили в рукопись новый рисунок 1G и фильм с конфокальным Z-сечением вращающегося диска (видео 5).

    B) Чтобы решить проблему, связанную с использованием ConA для выравнивания клеток S2, мы теперь включили новое видео (видео 1) и текст, чтобы прояснить этот вопрос (см. Подраздел «Центральный шпиндлинный комплекс, ABK и полокиназа локализуются в астральном пространстве»). МТ плюс-кончики после наступления анафазы и со временем формируются на экваториальных астральных МТ »в рукописи).Мы хотели бы отметить, что мы не наблюдали каких-либо дефектов сборки сократительного кольца и сужения, когда клетки S2 прикрепляются к ConA. Рисунок ниже адаптирован из видеороликов, которые мы ранее опубликовали (Ye, Torabi and Maresca, 2016), с конфокальной покадровой съемкой вращающегося диска делящихся клеток S2, коэкспрессирующих mCherry-α-тубулин и MRLC-EGFP. Трехмерные реконструкции конфокальных Z-стопок показывают сборку миозинового кольца и ограничение на покровном стекле, покрытом ConA. Чтобы решить эту проблему в настоящем исследовании, мы провели покадровую визуализацию клеток S2, засеянных на ConA, и обнаружили, что 97% делящихся клеток проникают в борозды в течение ± 10 минут после начала анафазы.Из этих клеток 32% завершают цитокинез нормально, в то время как 68% клеток регрессируют свои борозды, но через 39,4 ± 7,6 минут. Таким образом, концентрация ConA, которую мы используем на нашем покровном стекле, по-видимому, отрицательно влияет на цитокинетическое опадение или некоторые другие аспекты последних стадий цитокинеза, но не влияет на формирование борозды дробления или проникновение борозды, что является процессом, который мы изучаем. в этой работе.

    C) Мы также хотели бы отметить, что процент многоядерных клеток, представленный для условий +/- EB1, отражает поведение полуслипшихся клеток S2, которые росли в типичных 6-луночных планшетах для культивирования тканей с пластиковым дном в течение 4 дней и не расплющиваются на ConA до тех пор, пока они не будут засеяны в течение ≥45 минут, прежде чем клетки будут зафиксированы и окрашены.

    D) Чтобы обеспечить положительный контроль дефектов цитокинеза, мы истощили RacGAP50C в различных клеточных линиях (в 8 раз), и мы наблюдали 20-32-кратное увеличение процента двуядерных клеток по сравнению с исходными клетками, измеренными в контрольные условия РНКи (см. рисунок 6J; рисунок 1 — дополнение к рисунку 1 H, I и рисунок 6 — приложение к рисунку 2F).

    2) Есть расхождения между результатами, показанными здесь, и результатами Rogers et al. 2002. «Истощение EB1 в клетках S2 дрозофилы также вызывает дефекты веретена (Rogers et al., 2002), однако явных дефектов морфологии веретена мы не обнаружили. Хотя мы воспроизводимо достигли {больше или равно} 90% истощения EB1, это несоответствие может быть результатом разных уровней истощения EB1 ».

    Rogers et al. Продемонстрировали снижение динамичности микротрубочек, наблюдают ли авторы также этот эффект? Может ли невозможность увидеть дефекты шпинделя быть следствием использования визуализации TIRF, которая ограничивает глубину обзора?

    Спасибо, что указали на это.Как вы правильно заметили, мы не «всесторонне» анализировали другие аспекты (кроме сборки CS-TIP и дефектов цитокинеза) фенотипа истощения. Этот комментарий заставил нас пересмотреть наши данные, измерив длину шпинделя в контрольных и EB1-истощенных ячейках. В соответствии с Rogers et al., 2002, мы действительно измерили уменьшение длины веретена в EB1-истощенных клетках по сравнению с контрольными клетками (контрольная РНКи: 7,0 +/- 0,86 мкм, EB1 РНКи: 6,1 +/- 0,69 мкм; два- хвостовое p-значение из t-критерия Стьюдента = 4,31 E-12).Измеренное нами уменьшение длины веретена на 13% может отличаться от уменьшения на 30%, измеренного в Rogers et al., Из-за различий в экспериментальных условиях, таких как анализ живых клеток (us) и фиксированных клеток (Rogers) и / или продолжительность. лечения РНКи (4 дня (США) против 7 дней (Роджерс)).

    Тем не менее, теперь мы уверены, что наши условия истощения EB1 повторяют изменения в длине шпинделя в соответствии с опубликованными результатами EB1. Теперь мы включили новый текст (подраздел «EB1 необходим для надежной локализации компонентов CS-TIP на концах MT плюс кончик и способствует инициированию борозды и успешному завершению цитокинеза») и дополнительный рисунок (Рисунок 6 — приложение к рисунку 1B) в рукопись.

    3) Название: «Кончики микротрубочек действуют как сигнальные узлы для позиционирования борозды дробления во время цитокинеза».

    В отсутствие контролей, упомянутых в пункте 1, представленные данные не убедительно демонстрируют дефекты в позиционировании борозды дробления в отсутствие этих сигнальных узлов на плюс-кончиках MT. Например, хотя 4-кратное увеличение количества неделящихся клеток звучит впечатляюще, абсолютное число не особенно велико (10-15%). Соответственно, как может больше клеток не образовывать борозды, чем стать двуядерными?

    Спасибо, что подняли этот вопрос.Мы считаем, что должным образом рассмотрели ваши опасения, поднятые в пункте 1, но ваши комментарии заставили нас вернуться к нашему Заголовку. Мы действительно чувствуем, что CS-TIP необходимы для активации RhoA, и поэтому теперь мы изменили название, чтобы отразить это. Наш заголовок теперь гласит: «Кончики микротрубочек действуют как физические центры передачи сигналов, чтобы активировать RhoA во время цитокинеза».

    Учитывая важность цитокинеза, мы полагаем, что увеличение нарушения цитокинеза в 3-4 раза будет проблематичным для клеток. Однако мы признаем, что это меньшее число по сравнению с истощением MKLP1 или RacGAP50C может указывать на избыточные пути, которые требуют комплекса центральный шпиндлин.Мы изменили текст в разных местах, чтобы упомянуть о вероятной важности повторяющихся путей.

    Относительно вашего комментария относительно различий в отказе инициации борозды и двухъядерных ядрах, мы хотели бы отметить, что эти наборы данных были получены в двух разных экспериментах. Микроскопию живых клеток выполняли для оценки степени дефектов инициации борозды, в то время как IF на фиксированных клетках выполняли для оценки изменений в образовании двуядерных клеток, поэтому некоторые различия в наборах данных могут быть результатом этих различий.

    4) Рисунок 1

    Как определяется момент наступления анафазы в TIRF? От чего зависит время «предварительного формирования рисунка» и «последующего формирования рисунка». Например, время, указанное на рисунке 1, варьируется от 1A до 1B.

    В наших экспериментах α-тубулин флуоресцентно мечен, поэтому начало анафазы в поле TIRF определяется путем наблюдения за удлинением микротрубочек веретена. Кроме того, из-за сопутствующих изменений в динамике и распределении МТ большее количество микротрубочек начинает появляться в поле TIRF во время наступления анафазы.Это также наблюдалось и сообщалось в Vale et al., 2009.

    Мы определили предварительное формирование паттерна как момент времени, когда равномерная локализация компонентов CS-TIP (MKLP1, RacGAP50C, ABK и Polo kinase) видна на астральных MT плюс наконечниках (как полярных, так и экваториальных), а пост-паттерн определяется как момент времени, когда подавляющее большинство полярных CS-TIP теряется и остается на экваториальных MT. Неудивительно, что это явление варьируется от клетки к клетке. Фактически, некоторые клетки сохраняют несколько паразитных полярных CS-TIP более 10 минут.Теперь мы включили этот текст в легенду рисунка 1.

    5) Рисунок 4

    Потребность в Aurora B для ассоциации центральных шпиндлина с микротрубочками была показана ранее. (PMID 19962307, 20451386).

    То, что центральный шпиндлин может локализоваться зависимым от полярного сияния B образом без нормальной локализации северного сияния B, было показано ранее (PMID 15263015, рис. 2).

    Роль Plk1 в стимулировании сборки комплекса centralspindlin-Ect2 хорошо известна.(PMID 19468302, 19468300, 17488623, 17360533)

    Локализация центрального шпиндлина на концах микротрубочек напоминает локализацию, показанную Hu и Mitchison (PMID 18411311) в монополярных клетках. Это следует процитировать и обсудить.

    Хотя авторы цитируют соответствующие работы, эти цифры кажутся излишними.

    В ответ на A, B и C мы согласны с рецензентами, что потребность ABK в кластеризации и локализации центрального шпиндлина в средней зоне была показана ранее и широко обсуждалась.Однако в этих исследованиях (PMID 19962307, 20451386) не рассматривался вклад активности ABK в ассоциацию MT плюс-кончик комплекса центральный шпиндлин. Мы чувствуем, что продвинули предыдущие знания об образовании борозд дробления по крайней мере двумя способами: (1) Мы предоставили данные визуализации с высоким разрешением в реальном времени для комплекса центрального шпиндлина, ECT2 и динамики Rhotekin (активного RhoA) в клетках Drosophila S2, которые предыдущие отчеты отсутствуют, и далее мы показали, что RhoA может быть активирован сигналом на основе CS-TIP, что, по нашему мнению, является значительным дополнением к существующим знаниям.(2) Большинство предыдущих исследований было сосредоточено на передаче сигналов в средней зоне; наши данные представлены и проанализированы в контексте интересной и малоизученной популяции на MT + TIPs. Мы считаем важным определить, какие действия важны для локализации на основе TIP по сравнению с установленными требованиями для локализации в средней зоне. Точно так же потребность Plk1 в рекрутинге ECT2 хорошо известна, как указал этот обозреватель, но ни одно из этих исследований не фокусировалось на ассоциации Plk1 на основе микротрубочек + TIP, поэтому наше исследование важно для установления относительного вклада ABK и Polo в CS. -Советы сигнальные.

    Спасибо, что указали на сравнение Ху и Митчисона! Мы полностью согласны с вашей точкой зрения, и это действительно отличное дополнение. Мы расширили этот пункт в разделе «Обсуждение».

    6) Рисунок 6

    Делеция четырех аминокислот в середине глобулярной области белка может иметь серьезные последствия. Тот факт, что белок все еще локализуется, не является особенно хорошим контролем для этой мутации, поскольку локализация в средней зоне опосредуется N-концом белка, полностью отдельным доменом.Также кажется маловероятным, что этот пептид будет достаточно доступен для связывания EB1. Представленные данные в равной степени согласуются с этой мутацией, нарушающей взаимодействие с партнером по связыванию, который содержит мотив связывания EB1. Особенно опасно мутировать остаток пролина. Чтобы убедить этого рецензента в обратном, необходимо показать, что эти мутации не нарушают способность домена GAP связываться с RhoA • GTP. Доминирующий негативный эффект вызывает недоумение в соответствии с моделью авторов, поскольку простое предотвращение отслеживания центрального шпиндлина до кончиков MT должно быть менее серьезным, чем истощение EB1, которое может приводить к делокализации многих белков, включая центральный шпиндлин.Учитывая центральное значение этого момента для рукописи, этот момент требует значительного внимания.

    Мы согласны с этим рецензентом в том, что удаление остатка пролина может быть проблематичным, однако для оценки функциональной значимости этого консервативного мотива (PTIV) не так много доступных альтернативных методов, поэтому мы приступили к удалению этого мотива. Для решения этой проблемы рецензентов и следуя совету редактора относительно того, где сосредоточить наши экспериментальные усилия, мы теперь восстановили способность отслеживания кончиков мутантов RacGAP (∆C и ∆PT) путем их слияния с EB1 (рис. 6I, J).Хотя нам не удалось создать стабильные клеточные клетки с мутантами RacGAP, слияние EB1 позволило нам создать стабильные клеточные линии, в которых по крайней мере 50% клеток экспрессировали трансфицированную конструкцию с GFP-меткой. Это позволило нам провести функциональные эксперименты по спасению в отсутствие эндогенного белка RacGAP50C, используя WT, слитый с EB1, в качестве контроля. Новые результаты описаны в подразделе «Мутанты RacGAP50C, слитые с EB1, поддерживают активацию RhoA на основе MT плюс-кончика и могут устранить дефекты цитокинеза, связанные с истощением RacGAP50C», а также на новых рисунках (Рисунок 6J; Рисунок 1 — приложение к рисунку 1H, I и Рисунок 6 — добавление к рисунку 2F) добавлен, чтобы учесть это изменение.Поскольку мы наблюдали сравнимое восстановление% бинуклеатов в клетках, истощенных по RacGAP50C, как для мутантов WT, так и для мутантов δ PT, мы пришли к выводу, что помимо способности локализации кончика, другие связанные с цитокинезом функции мутанта ∆PTIV сохраняются. Однако, что касается вашей конкретной точки зрения об активности GAP, на примере Drosophila было показано, что активность GAP необходима для цитокинеза (Goldstein et al., 2005). Кроме того, вы подняли вопрос о доступности мотива PTIV для связывания EB1, в пересмотренной рукописи мы подняли этот вопрос и обсудили его значительно более подробно (см. Подраздел «Роль EB1 и консервативного мотива hxxPTxh в RacGAP50C. in cytokinesis ») в связи с недавней опубликованной нами работой по моторному белку NOD.

    7) Возможно, одним из самых интересных открытий является временной сдвиг от довольно глобального скопления кончиков к экваториально ориентированным кончикам. Учитывая частичное совпадение настоящей работы с ранее опубликованными, авторам было бы разумно лучше понять основу этого сдвига.

    Мы полностью согласны с рецензентом в том, что это действительно интересное открытие, однако мы считаем, что это направление исследования выходит за рамки настоящего исследования.Это, безусловно, будет будущим направлением расследования.

    8) Имеются убедительные доказательства того, что кортикально связанные микротрубочки в значительной степени не обязательны для Rho-зависимой сократимости (PMID 10837228, 20008563). Таким образом, не существует строгих общих требований для связывания EB1-зависимого центрального шпиндлина с плюс-кончиками. Тем не менее, авторы заявляют: «В целом эти результаты полностью подтверждают вывод о том, что CS-TIPs рекрутируют Rho-GEF, Dm ECT2, чтобы активировать кортикальный RhoA, что приводит к локальному накоплению миозина и индукции сократимости коры.«

    В общем, текст должен описывать, как эти положительные наконечники могут быть одним из нескольких средств, с помощью которых клетки генерируют центральный шпиндлин-активированный Ect2 на плазматической мембране (PMID 29738735).

    Спасибо, что указали на это. Мы осознали, что существует избыточность, и теперь изменили рукопись, чтобы отразить эти моменты (см. Раздел «Обсуждение»).

    9) Первые две страницы введения перефразируют дебаты об астральной стимуляции / астральном торможении / центральном веретене.Учитывая убедительные доказательства из множества систем, что существует множество способов, с помощью которых клетки могут генерировать область с высокой активностью RhoA, это обширное обсуждение является довольно излишним.

    Мы считаем, что соответствующая информация необходима для предоставления контекстной / справочной информации, и она особенно полезна для читателей, которые не знакомы с предысторией, поэтому мы хотели бы сохранить Введение как таковое.

    10) В целом рукопись недостаточно количественная.На рисунках 1, 2А, 3 и 5 показаны интересные явления. В общем, на протяжении всей рукописи неясно, сколько клеток наблюдали с определенными паттернами локализации, ни какая доля клеток на подобной стадии клеточного цикла демонстрирует этот паттерн. Результаты колокализации также качественные.

    Спасибо, что указали на это. Теперь мы включили значение n и соответствующую информацию, касающуюся количественного определения, в подписи к рисункам и в текст, когда это необходимо, чтобы избежать путаницы.

    11) Каковы уровни экспрессии трансгенов относительно эндогенных белков? Могут ли эти обильные очаги быть следствием сверхэкспрессии? Могут ли эндогенные белки быть обнаружены IMF в соответствующих сайтах в отсутствие сверхэкспрессии, или они могут быть обнаружены с помощью флуоресцентного мечения эндогенных генов?

    Спасибо, что указали на это, мы чувствуем, что проделали значительную работу для решения этой проблемы, которая показана на Рисунке 1F и Рисунке 1 — приложение к рисунку 1E.

    Чтобы решить эту проблему, мы выполнили вестерн-блоттинг линий клеток S2, экспрессирующих комплекс центральный шпиндлин. Количественный анализ вестерн-блоттинга показывает, что экспрессия трансгена Pavarotti-GFP в 5 раз ниже, чем экспрессия эндогенного Pavarotti (см. Рисунок 1F). Точно так же экспрессия трансгена RacGAP50C ниже, чем у его эндогенного аналога, и ее едва ли можно обнаружить с помощью антитела RacGAP50C. Поскольку наши белки не сверхэкспрессируются, мы решили не проводить эксперименты IF. Более того, предыдущие исследования на клетках Drosophila и млекопитающих, а также на эмбрионах Xenopus сообщили о локализации MKLP1 и MgcRacGAP (комплекс центрального шпиндлина) на MT плюс-кончике, а также компонента ABK CPC (Breznau et al., 2017; Нисимура и Йонемура, 2006; Vale et al., 2009).

    Рецензент № 2:

    Используя клеточную линию Drosophila S2 и TIRF микроскопию, Верма и Мареска наблюдали микротрубочки (MT) на плюс-конце и / или кортикальную локализацию нескольких важных регуляторов цитокинеза, включая две киназы, Aurora B и Polo. Отмена накопления этих факторов на плюсовых концах увеличивала частоту нарушения цитокинеза, что привело к заключению, что MT плюс кончики действуют как центры передачи сигналов для цитокинеза.

    Приведенные видеоданные высокого качества и убедительны с точки зрения динамики каждого фактора в нормальных условиях, а также после ингибирования киназы. Публикация этого исследования была бы оправдана, если бы авторы могли решить следующий важный вопрос.

    Существенные изменения:

    Я не был полностью убежден в ключевых данных этой рукописи: отмена локализации факторов цитокинеза на кончике МТ привела к сбою цитокинеза. В текущей рукописи авторы представили два набора данных в поддержку вывода.

    1) Истощение EB1 устраняет накопление факторов цитокинеза на плюсовом конце MT и дает двуядерные клетки.

    2) Удаление EB1-связывающего мотива отменяет накопление MT на плюс-конце RacGAP50C, и этот мутантный белок в основном вызывал нарушение цитокинеза при сверхэкспрессии.

    Что касается первых доказательств, разносторонние функции известны для EB1, включая регуляцию динамики MT плюс-концы, и неясно, какая функция (и) EB1 вызывает дефект цитокинеза.Данные согласуются с выводом авторов, но не служат его прямым доказательством.

    Напротив, оценка функции мутанта RacGAP50C напрямую устанавливает роль накопления на плюс-конце в цитокинезе. Однако текущий экспериментальный план, который использует сверхэкспрессию мутанта в клетках S2, которые обладают интактным RacGAP50C, предполагая, что мутант обладает доминантно-негативным эффектом, не является сложным. Авт. Должны вместо этого провести альтернативный эксперимент, в котором эндогенный RacGAP5C истощается, в то время как мутант (RNAi-нечувствительная версия) экспрессируется эктопически и временно.Кроме того, чтобы проверить модель авторов, датчик Rho и / или динамика миозина должны быть проанализированы в условиях замещения, а не просто подсчет количества двухъядерных клеток.

    Спасибо, что указали на это. Эти вопросы (1 и 2) также были подняты рецензентом 1 и редактором мониторинга, поэтому мы приложили значительные усилия для решения этих проблем. Чтобы избежать дублирования, ознакомьтесь с нашим ответом на пункт 6 выше.

    Следуя вашему совету, мы теперь показываем, что слияние EB1 с мутантом ∆C-RacGAP50C восстанавливает его активность отслеживания кончиков и запускает активацию и фокусировку RhoA около CS-TIP (см. Рисунок 6 — рисунок в приложении 2B), когда эндогенный RacGAP50C истощается из клеток. .Мы подробно обсудили это наблюдение в подразделе «Мутанты RacGAP50C, слитые с EB1, поддерживают активацию RhoA на основе MT plus-tip и могут спасти цитокинезные дефекты истощения RacGAP50C» рукописи.

    [Примечание редакции: следует письмо с решением после повторной проверки.]

    Рукопись была улучшена, но остаются некоторые проблемы, которые необходимо решить до принятия, как указано ниже:

    Обнаружение центрального шпиндлина на концах субнабора астральных микротрубочек и их способность индуцировать активацию RhoA интересно и хорошо задокументировано.Это хорошее дополнение к наблюдениям, сделанным на биполярных и монополярных клетках. Это предполагает, что баланс между центральным шпиндлином, накапливающимся на отдельных плюсовых концах и связанном плюсовых концах, может варьироваться в большей степени, чем считалось ранее.

    Однако многие результаты на рисунках 3 и 4 рукописи показывают значительное совпадение с предыдущими исследованиями. Хорошо известно, что активность киназы Aurora B (CPC может быть более подходящим сокращением) необходима для ассоциации центрального шпиндлина с обоими МТ.Сходным образом, хорошо установлено, что активность Plk1 необходима центральному шпиндлину для активации ECT-2 и, следовательно, стимулирования активности RhoA. Также известно, что MKLP2 вносит вклад в локализацию CPC, но функция CPC при локализации центрального шпиндлина, как известно, не зависит от MKLP2. Эти результаты были получены в различных системах и многократно пересмотрены, включая исчерпывающий обзор, сделанный ранее в этом году (Basant & Glotzer, Current Biology).

    Таким образом, мы предлагаем сосредоточить статью на более коротком отчете, который описывает обнаружение CS-TIP, их зависимость от EB1 и высокие пространственные и временные корреляции между совместной локализацией центрального шпиндлина, ECT-2 и активного RhoA.Это действительно хорошая визуализация серии связей, которая была изучена ранее, но со значительно лучшей пространственно-временной точностью.

    В ответ на вашу точку зрения мы удалили старую фигуру 4, которая показывает, что ингибирование активности ABK и Polo киназ влияет на активацию RhoA и рекрутирование ECT2. Мы сохранили видеофайлы, которые показывают движения смыва при визуализации Rhotekin и ECT2, и ссылаются на них в тексте. Мы также сохранили рисунок 3, потому что считаем важным описать вклад этих различных факторов в сборку CS-TIP.Это особенно важно для ингибирования ABK, поскольку предыдущая публикация (Vale, Spudich and Griffis, 2009), в которой использовались RNAi, пришла к выводу, что ABK не требуется для локализации плюс-кончика Dm MKLP1.

    1) Самое главное, есть опасения по поводу функционального анализа, включенного в статью. Ключевым экспериментом пересмотра было выяснение того, является ли дефект цитокинеза, вызванный истощением EB1, результатом смещения центрального шпиндлина с концов MT.Чтобы ответить на этот вопрос, можно было бы создать слитый белок EB1-центральный шпиндлин (и контроли) и оценить частоту сбоев цитокинеза после истощения EB1 — (т.е. исправляет ли это дефект на рис. 6 C, D). Конечно, нужно сделать часть слияния EB1 устойчивой к RNAi и предпочтительно мутировать мотивы связывания SxIP и PT, чтобы гарантировать, что в этих условиях отслеживается только кончик центрального шпиндлина.

    Эксперимент, представленный в 6 F-J, состоял в том, чтобы спросить, могут ли производные Cyk4 со слитым EB1 спасти истощение эндогенного Cyk4.Показанные результаты, по-видимому, не убедительно доказывают, что это спасает цитокинез в силу его способности «Tip Track» в отличие от других средств, с помощью которых центральный шпиндлин может индуцировать активацию RhoA.

    Связанный с этим экспериментом, раздел методов не описывает, как вы проводили спасательные эксперименты с Cyk4 (рис. 6) или MKLP1 (рис. 1F). Раздел, озаглавленный «Эксперименты по РНК-интерференции (RNAi)», не описывает методологию истощения Cyk4 или MKLP1. В тексте говорится: «Хотя праймеры РНКи (нацеленные на 3’UTR + 200 пар оснований кодирующей последовательности) были разработаны для истощения эндогенной копии, мы также часто наблюдали частичное истощение трансгена, что можно увидеть во всех вестерн-блотах.«Не следует ли перекодировать эти 200 пар оснований спасательной конструкции?

    Мы провели предложенный вами гибридный эксперимент EB1-RacGAP50C и обнаружили, что, в отличие от истощения EB1 в клетках WT, не было увеличения процента бинуклеатов, когда эндогенный EB1 истощался из клеток, экспрессирующих EB1-RacGAP50C.

    [Примечание редакции: до принятия были запрошены дополнительные исправления, как описано ниже.]

    Существенные изменения:

    1) Как упоминалось в предыдущей переписке, термин CS-TIP является несколько двусмысленным, и это остается так даже в пересмотренной версии.

    Во Введении термин определяется как «Dm MKLP1, RacGAP50C, ABK и Polo, каждый из которых локализует и отслеживает плюс-кончики астральных МТ в течение нескольких минут после начала анафазы, прежде чем они будут потеряны у большинства полярных астральных МТ и сохранены на экваториальных астральных МТ. Эти специализированные MT plus-наконечники были названы «TIP, сигнализирующими о цитокинезе», называемыми в дальнейшем CS-TIP, потому что они задействовали кортикальный ECT2 и локально активировали RhoA ».

    Это говорит о том, что CS-TIP включает центральный шпиндлин, Polo, Aurora B и ECT-2.

    Однако кинетика накопления Aurora B, ECT2 и центрального шпиндлина различна. Например, в подразделе «Комплекс центральный шпиндлин, ABK и Polo-киназа локализуются в плюс-кончиках астральных МТ после начала анафазы и со временем формируются на экваториальных астральных МТ» «Локализация ABK на CS-TIPs была очевидна за меньшее время (~ 1 минут), чем компоненты центрального шпиндлина, которые обычно длились 2-10 минут на полярных МТ и> 10 минут на экваториальных МТ ».

    Подраздел «CS-TIPs задействуют кортикальный Dm ECT2 (Pebble) при контакте и активируют RhoA» «В отличие от компонентов CS-TIP, Dm ECT2 не сильно отслеживал астральные MT (хотя наблюдались редкие события), скорее, кортикальный Dm ECT2 совмещен с плюс-наконечниками MT в пределах 10.5 {плюс минус} 1,0 секунды (среднее {плюс минус} стандартное отклонение, n = 21) контакта (рис. 2В), за которым следовало усиление набора Dm ECT2, достигающее пика 1,5 {плюс минус} 0,1 (среднее {плюс минус} стандартное отклонение) , n = 18) минут после того, как положительные кончики контактировали с корой (рис. 2C; видео 6) ».

    Таким образом, остается неоднозначным, когда положительный конец становится CS-TIP, особенно из-за отсутствия данных систематической совместной локализации. Когда накапливается центральный шпиндлин или Аврора В и центральный шпиндлин, или часть этих кончиков накапливает ECT2, когда достигают коры?

    Были изменены конкретные примеры, упомянутые выше.Рукопись также была отредактирована, чтобы более конкретно определить, когда мы рассматриваем, что плюс-конец MT способен действовать как подсказка для передачи сигналов цитокинеза (CS), а также было добавлено заявление о соответствующих компонентах для передачи сигналов.

    2) В подразделе «CS-TIPs задействуют кортикальный Dm ECT2 (Pebble) при контакте и активируют RhoA», результаты недостаточно четко указаны. Когда n = 23 или n = 18> = 95% равно 100% или <95%. Также статистика записывается как n = 22; 20/22 сот.Пожалуйста, используйте единый формат. количество / общее количество ячеек является самым простым.

    Во всей рукописи используется единообразное обозначение числа / общего количества.

    3) В подразделе «Исследование вклада компонентов мидзоны (ABK, Polo kinase, kinesin-4, MKLP2) в сборку CS-TIP» рукопись подробно описывает PRC1. Следующий эксперимент оценивает роль Klp3A. В то время как Klp3A может работать с PRC1, PRC1 может работать без него, поэтому в этом разделе следует уделять больше внимания Klp3A и меньше — PRC1, который не изучается.

    В этот раздел добавлено обсуждение Klp3A.

    4) Подраздел «Спутниковые МТ массивы, аналогичные мидзонным и астральным МТ, собираются в непосредственной близости от коры» «убедительные МТ-структуры» Принуждение очень субъективно, «МТ-структуры, которые собрались». было бы точнее.

    Изменение внесено.

    5) Подраздел «EB1 необходим для надежной локализации компонентов CS-TIP на MT плюс-кончике и способствует инициированию борозды и успешному завершению цитокинеза» и последующих.«Четырехкратное увеличение по сравнению с контрольными клетками» неясно, поскольку уровень в контрольных клетках не указан в тексте. Пожалуйста, укажите необработанное количество истощенных и контрольных ячеек где-нибудь в тексте этого раздела.

    В этот раздел добавлен конкретный процент бинуклеатов для истощенных и контрольных веществ.

    6) Подраздел «Мутанты RacGAP50C, слитые с EB1, поддерживают активацию RhoA на основе MT плюс-кончика и могут устранить дефекты цитокинеза, связанные с истощением RacGAP50C», по-видимому, мало что добавляют к рукописи.Во-первых, существует неожиданная сложность, заключающаяся в том, что вариант ∆PTIV действует как доминантно-отрицательный, увеличивая базальную частоту двуядерных клеток, что необъяснимо. Во-вторых, поскольку эта конструкция может работать как на подсказках МП, так и вне подсказок МП, она не позволяет делать какие-либо дополнительные выводы.

    Раздел (и связанные данные с рисунков) был удален. Рисунки отредактированы соответствующим образом.

    7) В то время как фон Дассов, 2009 обсуждается в подразделе «CS-TIP- против передачи сигналов на основе мидзоны в позиционировании борозды дробления», результаты этой статьи прямо противоречат предположениям также в подразделе «CS-TIP- и на основе мидзон». сигнализация позиционирования борозды деления ».

    «Еще одна интересная особенность режима передачи сигналов CS-TIP состоит в том, что он может играть более важную роль в более крупных клетках, таких как клетки в ранних эмбриональных делениях, где массив MT средней зоны находится далеко от коры». von Dassow, 2009 ясно показывает, что астральные кончики незаменимы для цитокинетического позиционирования в больших бластомерах. Это причина, по которой ссылка упоминалась в предыдущих раундах.

    Приговор снят.

    8) Подраздел «CS-TIP- против передачи сигналов на основе мидзоны в позиционировании борозды дробления».Было бы уместно сослаться на Basant, Glotzer, 2018, где это объяснение было предложено ранее.

    Добавлена ​​ссылка на Basant and Glotzer.

    9) Подраздел «Роль EB1 и консервативного мотива hxxPTxh в RacGAP50C в цитокинезе». Сообщите, пожалуйста, «отмеченные различия» из McKinley and Cheeseman, 2017 и Yang, 2017.

    McKinley et al., Сообщили о нарушениях веретена в ≥35% митотических клеток при двойном нокауте EB1 и EB3; однако Ян и др.сообщили о кажущихся нормальными митотических веретенах для клеток, в которых были нокаутированы все три белка EB (EB1, EB2 и EB3).

    10) Название: выражение «плюс-кончики», хотя и иногда используется в литературе, в некоторой степени неоднозначно, так как оно похоже на термин «+ TIPs», который относится к белкам, отслеживающим концы микротрубочек. Пожалуйста, подумайте о том, чтобы изменить название.

    Термин в названии изменен с «плюс-концы» на «положительный конец».

    https: // doi.org / 10.7554 / eLife.38968.043

    Зависящее от состояния блокирование мутантных каналов Orai3-V77C, активируемых 2-APB, с помощью …

    Контекст 1

    … тогда как каналы, активируемые 2-APB, сопротивляются открытию каналов, индуцированному STIM1 (Yamashita et al., 2011). Более того, 2-APB активирует Orai3, открывая и расширяя проводящую пору (Schindl et al., 2008), что приводит к неселективному, выпрямляющему внутрь и наружу катионному току, который биофизически отличается от тока Orai3, управляемого накопителем (активируемого STIM1).Химеры, состоящие из субдоменов Orai1 и Orai3, показали, что TM2-TM3 область Orai3 необходима для активации с помощью 2-APB (Zhang et al., 2008). Кроме того, мутация G183A в TM3 Orai1 приводит к каналам Orai1, которые также могут быть активированы 2-APB; и мутация гомологичного G158 в TM3 Orai3 в цистеин приводит к замедленной кинетике активации и вымывания 2-APB из-за образования дисульфидного мостика между введенным G158C и эндогенным TM2 C101 (Amcheslavsky et al., 2013).В совокупности эти данные предполагают, что 2-APB активирует Orai3 путем взаимодействия внутри области TM2-TM3, проксимальной к консервативному глицину, присутствующему в центре TM3 гомологов Orai. Однако полное понимание активированного 2-APB порового домена Orai3 отсутствует. Здесь мы используем целевой мутагенез цистеина, реагенты, реагирующие с тиолами, и анализ патч-кламп, чтобы идентифицировать подмножество остатков, которые помогают в формировании поры Orai3, активированной 2-APB. Мы сосредотачиваемся на конкретных остатках TM1, которые, как известно, выстилают поры каналов Orai1, управляемых магазином (McNally et al., 2009; Чжоу и др., 2010). Затем мы исследуем TM3 E165, консервативный остаток TM3, который, как было показано, влияет на селективность Ca 2+ в Orai1, управляемом STIM1, и Orai3, активируемом 2-APB (Prakriya et al., 2006; Schindl et al., 2008). Мы показываем, что определенные мутанты цистеина TM1 и TM3 демонстрируют зависимую от состояния блокировку тока CdCl 2 и / или 2-аминоэтилметантиосульфонатом (MTSEA), и обсуждаем наши результаты в контексте опубликованной кристаллической структуры dOrai (Hou et al., 2012) . Чтобы определить, участвуют ли остатки TM1, выстилающие управляемую магазином поры Orai1, в формировании поры Orai3, активируемой 2-APB, мы ввели мутации цистеина в гомологичные положения — Q83, E81, V77, G73, L70 и R66 — белка Orai3.Затем мы провели серию экспериментов, в которых сначала активировали эти мутантные каналы Orai3 с помощью 2-APB, а затем попытались заблокировать с помощью различных концентраций CdCl 2. Мы предположили, что электростатические взаимодействия между Cd 2+ и доступными сульфгидрильными группами введенных цистеинов внутри поры Orai3 могут привести к блокированию каналов. Во-первых, мы сравнили чувствительность к CdCl 2 в каналах WT и мутантного Orai3 и обнаружили, что каналам Orai3-WT требуются более высокие концентрации CdCl 2 для блокирования тока, активированного 2-APB (n = 10), чем для Orai3-Q83C (n = 4), Мутантные каналы Orai3-V77C (n = 6) и Orai3-L70C (n = 4).Типичные временные характеристики и соответствующие отношения I-V, взятые из экспериментов с блоком CdCl 2 для Orai3-WT, Orai3-Q83C, Orai3-V77C и Orai3-L70C, показаны на рис. 1 (A – H). Кривые доза-ответ CdCl 2 как для входящих, так и для внешних компонентов 2-APB-активированного тока Orai3-WT, Orai3-Q83C, Orai3-V77C и Orai3-L70C представлены на рис. 1 (I и J) и показывают ток остающийся после нанесения соответствующей концентрации CdCl 2. Эти кривые доза-ответ показывают, что мутации Q83C, V77C и L70C усиливают чувствительность к блокированию CdCl 2.Следовательно, остатки Q83, V77 и L70 участвуют в формировании поры Orai3, активируемой 2-APB. Мутантные каналы Orai3-E81C, Orai3-G73A, Orai3-G73C и Orai3-R66C не активировались при применении 2-APB во время экспериментов на целых клетках (плотности тока, активированные 2-APB, оставались значительно ниже 3 пА / пФ,> 100- раз меньше, чем плотность тока WT). Обработка восстанавливающим реагентом BMS во время активации 2-APB мутантных каналов Orai3-G73C и Orai3-R66C не увеличивала амплитуду тока.Этот результат, наряду с нефункциональными каналами G73A, предполагает, что мутации G73C и R66C изменяют чувствительность Orai3 к активации 2-APB или предотвращают образование проводящей поры. Отсутствие ответа на приложение 2-APB не является результатом блокады из-за образования межсубъединичного дисульфидного мостика, который может блокировать проводящий путь Orai3, активированный 2-APB. Эти данные суммированы на фиг. S1 в виде гистограмм, представляющих плотность тока, переносимую мутантами, по сравнению с каналами Orai3-WT. Реагенты MTS представляют собой тиол-реактивные зонды, которые взаимодействуют с доступным цистеинсульфгидрилом посредством ковалентной связи.Если реагент MTS ковалентно связывается с остатком цистеина в проводящем пути или поре ионного канала, проводимость канала блокируется до тех пор, пока взаимодействие не изменится на противоположное с использованием восстанавливающего реагента, такого как BMS. В нашей следующей серии экспериментов мы стремились протестировать Cd 2+ -чувствительные цистеиновые мутанты TM1, описанные в предыдущем разделе наших результатов, на блокировку положительно заряженными реагентами MTS. Мы обнаружили, что MTSEA (n = 3), MTSET (n = 3) и MTSEAE (n = 3) обратимо блокировали только активированные 2-APB каналы Orai3-WT (рис.2, А и Б; и рис. S2, A и B). Следовательно, четыре эндогенных цистеина Orai3, два в TM2 и два в петле TM3-TM4, либо не реагировали с применяемыми реагентами MTS, либо не реагировали таким образом, чтобы приводить к необратимой блокировке каналов. Аналогичным образом, применение BMS приводит к частичному подавлению активированного 2-APB тока Orai3. Однако активированные 2-APB каналы Orai3-V77C вели себя иначе. Почти 80% тока через Orai3-V77C было заблокировано MTSEA (n = 3) и оставалось заблокированным после промывки.Амплитуды тока вернулись к норме только после последующего нанесения и смывания BMS. Кроме того, больший MTSET не блокировал ток через Orai3-V77C (n = 3; рис. 2, C и D). Чтобы проверить зависимость состояния блока MTSEA, мы применили MTSEA к каналам Orai3-V77C во время перфузии по Рингеру, а не во время активации 2-APB, и обнаружили, что это не привело к блокированию каналов (рис. 2, E и F). . Таким образом, только поры в открытом состоянии Orai3-V77C достаточно широки, чтобы позволить MTSEA, но не MTSET, проникнуть, ковалентно реагировать с введенным остатком цистеина и блокировать ток.Эти данные суммированы в виде гистограмм с точки зрения процента тока, остающегося после обработки реагентом MTS, с BMS или без него, на рис. 2 G. Наши данные показывают, что остаток V77 расположен внутри поры Orai3, активированной 2-APB, и что при мутации в цистеин его реакция с MTSEA образует пробку, которая непосредственно ингибирует проводимость. Наконец, как и каналы Orai3-WT, каналы Orai3-Q83C и Orai3-L70C были устойчивы к необратимой блокировке с помощью MTSEA, MTSET или MTSTEAE (рис. S2). В следующей серии экспериментов мы стремились проверить, является ли более селективная, управляемая магазином пора Orai3 физически уже, чем активированная 2-APB пора Orai3, используя MTSEA в качестве зонда.Магазинные каналы Orai3-WT выставили только реверсивную блокировку тока по MTSEA; после отмывки реагента токи увеличивались до амплитуд, зарегистрированных до применения MTSEA (n = 3; рис. 3, A и B). Опять же, эндогенные цистеины Orai3 не реагировали с MTSEA или, по крайней мере, не реагировали таким образом, чтобы ингибировать проводимость. Однако, к нашему удивлению, ток Orai3-V77C, управляемый магазином, блокировался MTSEA и оставался заблокированным после смывания реагента (n = 8). Амплитуды тока Orai3-V77C вернулись к норме только после применения BMS (рис.3, В и Г). В целом, в среднем 55% потребляемого магазином тока через каналы Orai3-V77C было заблокировано приложением MTSEA (рис. 3 E). Хотя MTSEA блокирует больший процент активированного 2-APB тока Orai3 (≥80%), наши данные предполагают, что остаток V77 принимает непосредственное участие в образовании как 2-APB-активируемого, так и управляемого хранилищем (STIM1-активированного) Orai3 поры. Возможно, большая степень блокирования, проявляемого во время активации 2-APB, в отличие от активации, индуцированной STIM1, может быть объяснена большим диаметром расширенной 2-APB-активируемой поры Orai3.В следующей серии экспериментов мы стремились определить роль остатка Orai3 TM3 E165 в порообразовании. Как обсуждалось во введении, было показано, что E165 и его гомолог E190 Orai1 влияют на селективность по Ca 2+ и стробирование 2-APB (Prakriya et al., 2006; Vig et al., 2006a; Yamashita et al., 2007; Schindl. и др., 2008). Более того, хорошо установлено, что 2-APB активирует каналы Orai3 за счет расширения пор (Schindl et al., 2008). Мы предположили, что расширение пор с помощью 2-APB может позволить E165 двигаться к центральной оси или поре канала и, таким образом, взаимодействовать с поступающими ионами.Каналы Orai3, управляемые магазином, не расширены; следовательно, мы ожидали, что E165 будет играть меньшую роль в формировании управляемой хранилищем поры Orai3 и, следовательно, не будет взаимодействовать с поступающими ионами во время индуцированной STIM1 активации Orai3. Чтобы проверить эту гипотезу, мы нейтрализовали остаток и предположили, что удаление отрицательного заряда может снизить плотность тока, активированную 2-APB, но не управляемую накопителем. На первый взгляд, активированные 2-APB каналы Orai3-WT и Orai3-E165A кажутся схожими с точки зрения ионной селективности; оба проводят неселективные катионные токи, которые имеют внутреннюю и внешнюю выпрямляющую форму ВАХ.Однако по сравнению с Orai3-WT, активированным 2-APB (n = 7), экспрессия каналов Orai3-E165A (n = 7) приводила к увеличению селективности Ca 2+ и 20-кратному снижению тока, активируемого 2-APB. плотность (рис. 4, А – Д). Снижение плотности тока напоминает мутацию E165Q, которая также приводит к уменьшению активируемых 2-APB токов Orai3 (Schindl et al., 2008). Магазинные каналы Orai3-WT (n = 6) и Orai3-E165A (n = 5) были схожи по плотности тока (рис. 4, F – J). Кроме того, ни WT, ни мутантные каналы не показали увеличения амплитуды тока при замене раствора от 2 до 20 мМ Ca 2+ Ringer (рис.4, F – I). Предыдущие исследования показали, что как эндогенно экспрессируемые канальные токи CRAC (Bootman et al., 2001; Parekh and Putney, 2005), так и гетерологически экспрессируемые, управляемые магазином …

    Context 2

    … of соответствующие остатки для Orai3 представлены в модели гомологии (фиг. 6). На внеклеточной стороне TM1 остаток фильтра селективности, необходимый для селективности Ca 2+, был идентифицирован как E106 в Orai1 (Prakriya et al., 2006; Vig et al., 2006a; Yeromin et al., 2006) или E81 в Orai3 (Schindl et al., 2008; Demuro et al., 2011). На вершине TM1, V102 Orai1 (V77 в Orai3), как было показано, функционирует как гидрофобный вентиль; мутация V102C приводит к конститутивно активным каналам Orai1 (McNally et al., 2012). В центре TM1 G98 Orai1 (G73 в Orai3) требуется для нормального стробирования, вызванного STIM. Механизм дверных петель был предложен Zhang et al. (2011). Рядом с внутриклеточной стороной TM1 R91 в Orai1 (R66 в Orai3) способствует образованию узких и очень основных «ворот», которые создают электростатический барьер, через который ионы Ca 2+ не могут проходить (Feske et al., 2006; Дерлер и др., 2009; Zhang et al., 2011). Следовательно, когда R91 мутируется до объемных гидрофобных остатков, канал блокируется. Соответственно, исследования мутагенеза при сканировании цистеина, проведенные на Orai1 с магазинным управлением (McNally et al., 2009; Zhou et al., 2010), и опубликованная кристаллическая структура гомологичного, гипотетически закрытого состояния, dOrai (Hou et al., 2012), показали, что остатки TM1 сверху вниз участвуют в порообразовании. Помимо TM1, дополнительные функциональные исследования идентифицировали остатки Orai1 и Orai3 TM3, которые необходимы для селективности и стробирования каналов.Что касается внеклеточной стороны TM3, E190 Orai1 или E165 Orai3 (показано в модели гомологии; фиг. 6) также вносят вклад в селективность Ca 2+. Мутация Orai1 E190Q или мутация Orai3 E165Q приводят к изменению отношения IV, характерному для повышенной проницаемости Cs + (Prakriya et al., 2006; Vig et al., 2006a; Yamashita et al., 2007; Schindl et al., 2008). . В центре TM3 G183 в Orai1 (G158 из Orai3) необходим для нормального стробирования, индуцированного STIM, и активации 2-APB. Мутация Orai1 G183A придает чувствительность 2-APB (Srikanth et al., 2011), тогда как мутация Orai3 G158C приводит к медленной кинетике активации и вымывания 2-APB из-за образования дисульфидного мостика между введенным G158C и эндогенным TM2 C101 (Amcheslavsky et al., 2013). Однако вышеупомянутые исследования сканирования цистеина и кристаллической структуры dOrai не идентифицировали эти остатки TM3 как необходимые для формирования пор канала Orai. В частности, не было выдвинуто никаких гипотез или обнаруженных механизмов того, как глутамат TM3 может влиять на селективность Ca 2+.Следовательно, со структурной точки зрения функциональный вклад этого консервативного глутамата TM3 (E190 в Orai1, E165 в Orai3) остался необъясненным. Более того, активированная 2-APB пора канала Orai3, расширенная и, следовательно, неселективная, характеризующаяся двухфазной I-V формой с внутренним и наружным выпрямлением, не исследовалась. В этом исследовании мы стремились углубить структурное понимание каналов Orai с помощью целевого мутагенеза цистеина, тиол-реактивных реагентов и анализа патч-клэмп к 2-APB-активированному Orai3.Наше исследование исследует поры канала Orai3, активируемые 2-APB, с помощью цистеинового мутагенеза в нескольких сайтах в TM1 и на E165 TM3. Мы показываем, что 2-APB-активируемые каналы Orai3-WT нуждаются в более высоких концентрациях CdCl 2 для блокирования тока, чем управляемые магазином Orai3 (Fig. 5) или Orai1 каналы (McNally et al., 2009). Кроме того, хотя мутанты Orai3 E81C, G73A, G73C и R66C не образовывали каналов, способных проводить в ответ на стимуляцию 2-APB (рис. S1), мутанты Orai3 Q83C, V77C, L70C, E165A и E165C дают представление о структурной состав поры канала Orai3, активированного 2-APB.Чтобы проиллюстрировать это, мы транспонировали остатки Orai3 Q83, V77, L70C и E165 вместе с остатком фильтра селективности E81 для сравнения на кристаллическую структуру dOrai (фиг. 6). Из четырех детально изученных остатков Q83 является наиболее внеклеточным, он расположен непосредственно над фильтром селективности E81 (фиг. 6, A, B и F). Каналы Orai3-Q83C чувствительны к блокированию ионами Cd 2+; однако амплитуда тока мгновенно возрастает после вымывания нанесенного CdCl 2 (рис. 1). Кроме того, реагенты MTS не вызывают блокировку 2-APB– активированного тока, переносимого по каналам Orai3-Q83C (рис.S2, C – H). Мы предполагаем, что, хотя позиция 83 находится выше поры, она не находится непосредственно внутри поры, и поэтому ковалентное взаимодействие между реагентами Q83C и MTS не приведет к резкой блокировке тока. Вместо этого ковалентно связанный реагент MTS будет создавать только небольшие стерические препятствия для ионов, когда они входят в путь проводимости 2-APB-активированного Orai3. Мы обнаружили, что каналы Orai3-V77C очень чувствительны к блокированию ионами Cd 2+, в большей степени, чем мутантные каналы Q83C, L70C или E165C (рис.1 и 5). Кроме того, как активированные 2-APB, так и управляемые хранилищем каналы Orai3-V77C чувствительны к блокированию MTSEA (рис. 2 и 3), а блок, вызванный MTSEA, зависит от состояния, поскольку MTSEA не может блокировать Orai3-V77C перед каналом. проем (рис. 2). Тот факт, что MTSEA блокирует активированные 2-APB каналы Orai3, согласуется с расширением поры канала Orai3, активируемого 2-APB, что приводит к неселективному и более широкому открытому каналу, чем каналы Orai, управляемые магазином. Кроме того, V77 идеально расположен на центральной оси канала, прямо под фильтром селективности E81 (рис.6, A, C и G), и его реакция с MTSEA образует пробку, которая может напрямую препятствовать проводимости. Однако блок MTSEA управляемого хранилища Orai3-V77C стал неожиданностью, поскольку реагенты MTS неспособны проникать через узкую, селективную по Ca 2+, управляемую хранилищем поры Orai1 (McNally et al., 2009). Единственный мутант по цистеину Orai1, способный взаимодействовать с MTSEA, имеет расширенные поры, индуцированные вторичной мутацией в селективном фильтре E106 (Orai1-E106D / G98C; McNally et al., 2012). Поскольку позиция V77 является более внутриклеточной, чем фильтр селективности E81, и все же каналы Orai3-V77C, лишенные вторичной гомологичной мутации E81D, могут взаимодействовать с MTSEA, вызывая необратимую, зависимую от состояния блокировку каналов, мы предполагаем, что каналы Orai3 с хранением в памяти действуют в на самом деле имеют более широкие поры, чем магазинные каналы Orai1.Наконец, каналы Orai3-V77C и гомологичные мутантные каналы Orai1-V102C, как сообщается, проводят предварительно активированные, неселективные токи (McNally et al., 2012). В наших руках каналы Orai3- V77C не были предварительно активированы. Позиция L70 в TM1 даже глубже в поре, чем V77 (рис. 6, A, D и H). Хотя мутантные каналы Orai3-L70C более чувствительны к блокированию с помощью Cd 2+, чем каналы Orai3-WT, они не обнаруживают индуцированного реагентом MTS необратимого блока тока, активируемого 2-APB (Fig. S2, I и J).Возможно, L70C находится слишком глубоко в поре или ему мешают более объемные внеклеточные остатки, такие как F74, которые не могут быть достигнуты более объемными реагентами MTS. Наши данные показывают, что активированная 2-APB пора Orai3 выстлана по крайней мере тремя остатками TM1: Q83, V77 и L70. Остальные протестированные нами мутанты цистеина TM1, E81C, G73C и R66C, утратили чувствительность к активации 2-APB. Следовательно, мы не можем с уверенностью сказать, участвуют ли эти остатки в формировании 2-APB– активированной поры Orai3. Однако, поскольку E81 формирует фильтр селективности, мы заключаем, что Q83, E81, V77 и L70 все участвуют в образовании поры, активированной 2-APB.Зависимые от состояния эффекты мутаций Orai3 TM3 иллюстрируют, как поры, активируемые 2-APB, могут отличаться от поры, управляемой хранилищами. Мутация E165A снижает плотности тока Orai3, активируемого 2-APB; однако он не изменяет плотность тока, передаваемого по каналам Orai3 с накопительным управлением (рис. 4). Кроме того, позиция 165 внутри канала Orai3, как предсказано кристаллической структурой dOrai (рис. 6, A, E и I), расположена непосредственно позади и между двумя порообразующими спиралями TM1. Мы предположили, что во время расширения поры, вызванного 2-APB, позиция 165 может перемещаться к центральной оси канала, тем самым влияя на проницаемость канала.Возможно, мутация E165A ингибирует собственное образование расширенной 2-APB-активированной поры Orai3. Запасная пора, которая, как известно, исключает остатки TM3 из пути проводимости, будет исключать E165 из пути проводимости, содержащего TM1, и, таким образом, мутация E165A будет иметь небольшое влияние на формирование поры с запоминанием или плотность тока. В соответствии с этой гипотезой мутация E165C увеличивала проницаемость Cs + через запоминающуюся пору Orai3, но не повышала чувствительность к блоку CdCl 2.Фактически, по сравнению с каналами Orai3-WT, управляемыми магазином, каналы Orai3-E165C, управляемые магазином, были примерно в два раза менее чувствительны к блокированию CdCl 2. Однако активированные 2-APB каналы Orai3-E165C были почти в три раза более чувствительны к блокированию с помощью CdCl 2, чем каналы Orai3-WT, активируемые 2-APB (рис. 5). Наши данные предполагают, что E165C способен проникать через 2-APB-активируемый путь проводимости Orai3 и, таким образом, способен взаимодействовать с поступающими ионами Cd 2+. Сравнение зависимых от состояния эффектов мутаций E165A и E165C на токи Orai3, активируемые 2-APB и управляемые магазином, приводит нас к выводу, что позиция 165 внутри Orai3 перемещается к центральной оси канала и, следовательно, способствует образованию пор, но только когда канал активируется и расширяется…

    Контекст 3

    … приводит к замедленной кинетике активации и вымывания 2-APB из-за образования дисульфидного мостика между введенным G158C и эндогенным TM2 C101 (Amcheslavsky et al., 2013). В совокупности эти данные предполагают, что 2-APB активирует Orai3 путем взаимодействия внутри области TM2-TM3, проксимальной к консервативному глицину, присутствующему в центре TM3 гомологов Orai. Однако полное понимание активированного 2-APB порового домена Orai3 отсутствует.Здесь мы используем целевой мутагенез цистеина, реагенты, реагирующие с тиолами, и анализ патч-кламп, чтобы идентифицировать подмножество остатков, которые помогают в формировании поры Orai3, активированной 2-APB. Мы сосредотачиваемся на специфических остатках TM1, которые, как известно, выстилают поры каналов Orai1, управляемых хранилищами (McNally et al., 2009; Zhou et al., 2010). Затем мы исследуем TM3 E165, консервативный остаток TM3, который, как было показано, влияет на селективность Ca 2+ в Orai1, управляемом STIM1, и Orai3, активированном 2-APB (Prakriya et al., 2006; Schindl et al., 2008). Мы показываем, что определенные мутанты цистеина TM1 и TM3 демонстрируют зависимую от состояния блокировку тока CdCl 2 и / или 2-аминоэтилметантиосульфонатом (MTSEA), и обсуждаем наши результаты в контексте опубликованной кристаллической структуры dOrai (Hou et al., 2012) . Чтобы определить, участвуют ли остатки TM1, выстилающие управляемую магазином поры Orai1, в формировании поры Orai3, активируемой 2-APB, мы ввели мутации цистеина в гомологичные положения — Q83, E81, V77, G73, L70 и R66 — белка Orai3.Затем мы провели серию экспериментов, в которых сначала активировали эти мутантные каналы Orai3 с помощью 2-APB, а затем попытались заблокировать с помощью различных концентраций CdCl 2. Мы предположили, что электростатические взаимодействия между Cd 2+ и доступными сульфгидрильными группами введенных цистеинов внутри поры Orai3 могут привести к блокированию каналов. Во-первых, мы сравнили чувствительность к CdCl 2 в каналах WT и мутантного Orai3 и обнаружили, что каналам Orai3-WT требуются более высокие концентрации CdCl 2 для блокирования тока, активированного 2-APB (n = 10), чем для Orai3-Q83C (n = 4), Мутантные каналы Orai3-V77C (n = 6) и Orai3-L70C (n = 4).Типичные временные характеристики и соответствующие отношения I-V, взятые из экспериментов с блоком CdCl 2 для Orai3-WT, Orai3-Q83C, Orai3-V77C и Orai3-L70C, показаны на рис. 1 (A – H). Кривые доза-ответ CdCl 2 как для входящих, так и для внешних компонентов 2-APB-активированного тока Orai3-WT, Orai3-Q83C, Orai3-V77C и Orai3-L70C представлены на рис. 1 (I и J) и показывают ток остающийся после нанесения соответствующей концентрации CdCl 2. Эти кривые доза-ответ показывают, что мутации Q83C, V77C и L70C усиливают чувствительность к блокированию CdCl 2.Следовательно, остатки Q83, V77 и L70 участвуют в формировании поры Orai3, активируемой 2-APB. Мутантные каналы Orai3-E81C, Orai3-G73A, Orai3-G73C и Orai3-R66C не активировались при применении 2-APB во время экспериментов на целых клетках (плотности тока, активированные 2-APB, оставались значительно ниже 3 пА / пФ,> 100- раз меньше, чем плотность тока WT). Обработка восстанавливающим реагентом BMS во время активации 2-APB мутантных каналов Orai3-G73C и Orai3-R66C не увеличивала амплитуду тока.Этот результат, наряду с нефункциональными каналами G73A, предполагает, что мутации G73C и R66C изменяют чувствительность Orai3 к активации 2-APB или предотвращают образование проводящей поры. Отсутствие ответа на приложение 2-APB не является результатом блокады из-за образования межсубъединичного дисульфидного мостика, который может блокировать проводящий путь Orai3, активированный 2-APB. Эти данные суммированы на фиг. S1 в виде гистограмм, представляющих плотность тока, переносимую мутантами, по сравнению с каналами Orai3-WT. Реагенты MTS представляют собой тиол-реактивные зонды, которые взаимодействуют с доступным цистеинсульфгидрилом посредством ковалентной связи.Если реагент MTS ковалентно связывается с остатком цистеина в проводящем пути или поре ионного канала, проводимость канала блокируется до тех пор, пока взаимодействие не изменится на противоположное с использованием восстанавливающего реагента, такого как BMS. В нашей следующей серии экспериментов мы стремились протестировать Cd 2+ -чувствительные цистеиновые мутанты TM1, описанные в предыдущем разделе наших результатов, на блокировку положительно заряженными реагентами MTS. Мы обнаружили, что MTSEA (n = 3), MTSET (n = 3) и MTSEAE (n = 3) обратимо блокировали только активированные 2-APB каналы Orai3-WT (рис.2, А и Б; и рис. S2, A и B). Следовательно, четыре эндогенных цистеина Orai3, два в TM2 и два в петле TM3-TM4, либо не реагировали с применяемыми реагентами MTS, либо не реагировали таким образом, чтобы приводить к необратимой блокировке каналов. Аналогичным образом, применение BMS приводит к частичному подавлению активированного 2-APB тока Orai3. Однако активированные 2-APB каналы Orai3-V77C вели себя иначе. Почти 80% тока через Orai3-V77C было заблокировано MTSEA (n = 3) и оставалось заблокированным после промывки.Амплитуды тока вернулись к норме только после последующего нанесения и смывания BMS. Кроме того, больший MTSET не блокировал ток через Orai3-V77C (n = 3; рис. 2, C и D). Чтобы проверить зависимость состояния блока MTSEA, мы применили MTSEA к каналам Orai3-V77C во время перфузии по Рингеру, а не во время активации 2-APB, и обнаружили, что это не привело к блокированию каналов (рис. 2, E и F). . Таким образом, только поры в открытом состоянии Orai3-V77C достаточно широки, чтобы позволить MTSEA, но не MTSET, проникнуть, ковалентно реагировать с введенным остатком цистеина и блокировать ток.Эти данные суммированы в виде гистограмм с точки зрения процента тока, остающегося после обработки реагентом MTS, с BMS или без него, на рис. 2 G. Наши данные показывают, что остаток V77 расположен внутри поры Orai3, активированной 2-APB, и что при мутации в цистеин его реакция с MTSEA образует пробку, которая непосредственно ингибирует проводимость. Наконец, как и каналы Orai3-WT, каналы Orai3-Q83C и Orai3-L70C были устойчивы к необратимой блокировке с помощью MTSEA, MTSET или MTSTEAE (рис. S2). В следующей серии экспериментов мы стремились проверить, является ли более селективная, управляемая магазином пора Orai3 физически уже, чем активированная 2-APB пора Orai3, используя MTSEA в качестве зонда.Магазинные каналы Orai3-WT выставили только реверсивную блокировку тока по MTSEA; после отмывки реагента токи увеличивались до амплитуд, зарегистрированных до применения MTSEA (n = 3; рис. 3, A и B). Опять же, эндогенные цистеины Orai3 не реагировали с MTSEA или, по крайней мере, не реагировали таким образом, чтобы ингибировать проводимость. Однако, к нашему удивлению, ток Orai3-V77C, управляемый магазином, блокировался MTSEA и оставался заблокированным после смывания реагента (n = 8). Амплитуды тока Orai3-V77C вернулись к норме только после применения BMS (рис.3, В и Г). В целом, в среднем 55% потребляемого магазином тока через каналы Orai3-V77C было заблокировано приложением MTSEA (рис. 3 E). Хотя MTSEA блокирует больший процент активированного 2-APB тока Orai3 (≥80%), наши данные предполагают, что остаток V77 принимает непосредственное участие в образовании как 2-APB-активируемого, так и управляемого хранилищем (STIM1-активированного) Orai3 поры. Возможно, большая степень блокирования, проявляемого во время активации 2-APB, в отличие от активации, индуцированной STIM1, может быть объяснена большим диаметром расширенной 2-APB-активируемой поры Orai3.В следующей серии экспериментов мы стремились определить роль остатка Orai3 TM3 E165 в порообразовании. Как обсуждалось во введении, было показано, что E165 и его гомолог E190 Orai1 влияют на селективность по Ca 2+ и стробирование 2-APB (Prakriya et al., 2006; Vig et al., 2006a; Yamashita et al., 2007; Schindl. и др., 2008). Более того, хорошо установлено, что 2-APB активирует каналы Orai3 за счет расширения пор (Schindl et al., 2008). Мы предположили, что расширение пор с помощью 2-APB может позволить E165 двигаться к центральной оси или поре канала и, таким образом, взаимодействовать с поступающими ионами.Каналы Orai3, управляемые магазином, не расширены; следовательно, мы ожидали, что E165 будет играть меньшую роль в формировании управляемой хранилищем поры Orai3 и, следовательно, не будет взаимодействовать с поступающими ионами во время индуцированной STIM1 активации Orai3. Чтобы проверить эту гипотезу, мы нейтрализовали остаток и предположили, что удаление отрицательного заряда может снизить плотность тока, активированную 2-APB, но не управляемую накопителем. На первый взгляд, активированные 2-APB каналы Orai3-WT и Orai3-E165A кажутся схожими с точки зрения ионной селективности; оба проводят неселективные катионные токи, которые имеют внутреннюю и внешнюю выпрямляющую форму ВАХ.Однако по сравнению с Orai3-WT, активированным 2-APB (n = 7), экспрессия каналов Orai3-E165A (n = 7) приводила к увеличению селективности Ca 2+ и 20-кратному снижению тока, активируемого 2-APB. плотность (рис. 4, А – Д). Снижение плотности тока напоминает мутацию E165Q, которая также приводит к уменьшению активируемых 2-APB токов Orai3 (Schindl et al., 2008). Магазинные каналы Orai3-WT (n = 6) и Orai3-E165A (n = 5) были схожи по плотности тока (рис. 4, F – J). Кроме того, ни WT, ни мутантные каналы не показали увеличения амплитуды тока при замене раствора от 2 до 20 мМ Ca 2+ Ringer (рис.4, F – I). Предыдущие исследования показали, что как эндогенно экспрессируемые токи каналов CRAC (Bootman et al., 2001; Parekh and Putney, 2005), так и гетерологически экспрессируемые токи каналов Orai1 и dOrai, управляемые магазином (Yeromin et al., 2004; Zhang et al., al., 2008) удваивается по амплитуде при внешнем обмене раствора с 2 мМ до 6–20 мМ Ca 2+. Следовательно, удивительно, что аналогичный протокол обмена решениями не увеличивает амплитуду тока Orai3 с запоминающим устройством. Результат предполагает, что Orai3, управляемый магазином, не так селективен по Ca 2+, как Orai1 или dOrai.Еще один аспект накопительного тока Orai3-E165A, который следует отметить, — это увеличенная наружная составляющая, переносимая ионами цезия (Cs +; рис. 4, H – J). Это свойство тока не было неожиданностью, поскольку мутация гомологичного остатка E190 Orai1 в глютамин также увеличивает проницаемость для Cs + (Prakriya et …

    Контекст 4

    … активирует Orai3, взаимодействуя внутри область TM2-TM3 проксимальнее консервативного глицина, присутствующего в центре TM3 гомологов Orai.Однако полное понимание активированного 2-APB порового домена Orai3 отсутствует. Здесь мы используем целевой мутагенез цистеина, реагенты, реагирующие с тиолами, и анализ патч-кламп, чтобы идентифицировать подмножество остатков, которые помогают в формировании поры Orai3, активированной 2-APB. Мы сосредотачиваемся на специфических остатках TM1, которые, как известно, выстилают поры каналов Orai1, управляемых хранилищами (McNally et al., 2009; Zhou et al., 2010). Затем мы исследуем TM3 E165, консервативный остаток TM3, который, как было показано, влияет на селективность Ca 2+ в Orai1, управляемом STIM1, и Orai3, активированном 2-APB (Prakriya et al., 2006; Schindl et al., 2008). Мы показываем, что определенные мутанты цистеина TM1 и TM3 демонстрируют зависимую от состояния блокировку тока CdCl 2 и / или 2-аминоэтилметантиосульфонатом (MTSEA), и обсуждаем наши результаты в контексте опубликованной кристаллической структуры dOrai (Hou et al., 2012) . Чтобы определить, участвуют ли остатки TM1, выстилающие управляемую магазином поры Orai1, в формировании поры Orai3, активируемой 2-APB, мы ввели мутации цистеина в гомологичные положения — Q83, E81, V77, G73, L70 и R66 — белка Orai3.Затем мы провели серию экспериментов, в которых сначала активировали эти мутантные каналы Orai3 с помощью 2-APB, а затем попытались заблокировать с помощью различных концентраций CdCl 2. Мы предположили, что электростатические взаимодействия между Cd 2+ и доступными сульфгидрильными группами введенных цистеинов внутри поры Orai3 могут привести к блокированию каналов. Во-первых, мы сравнили чувствительность к CdCl 2 в каналах WT и мутантного Orai3 и обнаружили, что каналам Orai3-WT требуются более высокие концентрации CdCl 2 для блокирования тока, активированного 2-APB (n = 10), чем для Orai3-Q83C (n = 4), Мутантные каналы Orai3-V77C (n = 6) и Orai3-L70C (n = 4).Типичные временные характеристики и соответствующие отношения I-V, взятые из экспериментов с блоком CdCl 2 для Orai3-WT, Orai3-Q83C, Orai3-V77C и Orai3-L70C, показаны на рис. 1 (A – H). Кривые доза-ответ CdCl 2 как для входящих, так и для внешних компонентов 2-APB-активированного тока Orai3-WT, Orai3-Q83C, Orai3-V77C и Orai3-L70C представлены на рис. 1 (I и J) и показывают ток остающийся после нанесения соответствующей концентрации CdCl 2. Эти кривые доза-ответ показывают, что мутации Q83C, V77C и L70C усиливают чувствительность к блокированию CdCl 2.Следовательно, остатки Q83, V77 и L70 участвуют в формировании поры Orai3, активируемой 2-APB. Мутантные каналы Orai3-E81C, Orai3-G73A, Orai3-G73C и Orai3-R66C не активировались при применении 2-APB во время экспериментов на целых клетках (плотности тока, активированные 2-APB, оставались значительно ниже 3 пА / пФ,> 100- раз меньше, чем плотность тока WT). Обработка восстанавливающим реагентом BMS во время активации 2-APB мутантных каналов Orai3-G73C и Orai3-R66C не увеличивала амплитуду тока.Этот результат, наряду с нефункциональными каналами G73A, предполагает, что мутации G73C и R66C изменяют чувствительность Orai3 к активации 2-APB или предотвращают образование проводящей поры. Отсутствие ответа на приложение 2-APB не является результатом блокады из-за образования межсубъединичного дисульфидного мостика, который может блокировать проводящий путь Orai3, активированный 2-APB. Эти данные суммированы на фиг. S1 в виде гистограмм, представляющих плотность тока, переносимую мутантами, по сравнению с каналами Orai3-WT. Реагенты MTS представляют собой тиол-реактивные зонды, которые взаимодействуют с доступным цистеинсульфгидрилом посредством ковалентной связи.Если реагент MTS ковалентно связывается с остатком цистеина в проводящем пути или поре ионного канала, проводимость канала блокируется до тех пор, пока взаимодействие не изменится на противоположное с использованием восстанавливающего реагента, такого как BMS. В нашей следующей серии экспериментов мы стремились протестировать Cd 2+ -чувствительные цистеиновые мутанты TM1, описанные в предыдущем разделе наших результатов, на блокировку положительно заряженными реагентами MTS. Мы обнаружили, что MTSEA (n = 3), MTSET (n = 3) и MTSEAE (n = 3) обратимо блокировали только активированные 2-APB каналы Orai3-WT (рис.2, А и Б; и рис. S2, A и B). Следовательно, четыре эндогенных цистеина Orai3, два в TM2 и два в петле TM3-TM4, либо не реагировали с применяемыми реагентами MTS, либо не реагировали таким образом, чтобы приводить к необратимой блокировке каналов. Аналогичным образом, применение BMS приводит к частичному подавлению активированного 2-APB тока Orai3. Однако активированные 2-APB каналы Orai3-V77C вели себя иначе. Почти 80% тока через Orai3-V77C было заблокировано MTSEA (n = 3) и оставалось заблокированным после промывки.Амплитуды тока вернулись к норме только после последующего нанесения и смывания BMS. Кроме того, больший MTSET не блокировал ток через Orai3-V77C (n = 3; рис. 2, C и D). Чтобы проверить зависимость состояния блока MTSEA, мы применили MTSEA к каналам Orai3-V77C во время перфузии по Рингеру, а не во время активации 2-APB, и обнаружили, что это не привело к блокированию каналов (рис. 2, E и F). . Таким образом, только поры в открытом состоянии Orai3-V77C достаточно широки, чтобы позволить MTSEA, но не MTSET, проникнуть, ковалентно реагировать с введенным остатком цистеина и блокировать ток.Эти данные суммированы в виде гистограмм с точки зрения процента тока, остающегося после обработки реагентом MTS, с BMS или без него, на рис. 2 G. Наши данные показывают, что остаток V77 расположен внутри поры Orai3, активированной 2-APB, и что при мутации в цистеин его реакция с MTSEA образует пробку, которая непосредственно ингибирует проводимость. Наконец, как и каналы Orai3-WT, каналы Orai3-Q83C и Orai3-L70C были устойчивы к необратимой блокировке с помощью MTSEA, MTSET или MTSTEAE (рис. S2). В следующей серии экспериментов мы стремились проверить, является ли более селективная, управляемая магазином пора Orai3 физически уже, чем активированная 2-APB пора Orai3, используя MTSEA в качестве зонда.Магазинные каналы Orai3-WT выставили только реверсивную блокировку тока по MTSEA; после отмывки реагента токи увеличивались до амплитуд, зарегистрированных до применения MTSEA (n = 3; рис. 3, A и B). Опять же, эндогенные цистеины Orai3 не реагировали с MTSEA или, по крайней мере, не реагировали таким образом, чтобы ингибировать проводимость. Однако, к нашему удивлению, ток Orai3-V77C, управляемый магазином, блокировался MTSEA и оставался заблокированным после смывания реагента (n = 8). Амплитуды тока Orai3-V77C вернулись к норме только после применения BMS (рис.3, В и Г). В целом, в среднем 55% потребляемого магазином тока через каналы Orai3-V77C было заблокировано приложением MTSEA (рис. 3 E). Хотя MTSEA блокирует больший процент активированного 2-APB тока Orai3 (≥80%), наши данные предполагают, что остаток V77 принимает непосредственное участие в образовании как 2-APB-активируемого, так и управляемого хранилищем (STIM1-активированного) Orai3 поры. Возможно, большая степень блокирования, проявляемого во время активации 2-APB, в отличие от активации, индуцированной STIM1, может быть объяснена большим диаметром расширенной 2-APB-активируемой поры Orai3.В следующей серии экспериментов мы стремились определить роль остатка Orai3 TM3 E165 в порообразовании. Как обсуждалось во введении, было показано, что E165 и его гомолог E190 Orai1 влияют на селективность по Ca 2+ и стробирование 2-APB (Prakriya et al., 2006; Vig et al., 2006a; Yamashita et al., 2007; Schindl. и др., 2008). Более того, хорошо установлено, что 2-APB активирует каналы Orai3 за счет расширения пор (Schindl et al., 2008). Мы предположили, что расширение пор с помощью 2-APB может позволить E165 двигаться к центральной оси или поре канала и, таким образом, взаимодействовать с поступающими ионами.Каналы Orai3, управляемые магазином, не расширены; следовательно, мы ожидали, что E165 будет играть меньшую роль в формировании управляемой хранилищем поры Orai3 и, следовательно, не будет взаимодействовать с поступающими ионами во время индуцированной STIM1 активации Orai3. Чтобы проверить эту гипотезу, мы нейтрализовали остаток и предположили, что удаление отрицательного заряда может снизить плотность тока, активированную 2-APB, но не управляемую накопителем. На первый взгляд, активированные 2-APB каналы Orai3-WT и Orai3-E165A кажутся схожими с точки зрения ионной селективности; оба проводят неселективные катионные токи, которые имеют внутреннюю и внешнюю выпрямляющую форму ВАХ.Однако по сравнению с Orai3-WT, активированным 2-APB (n = 7), экспрессия каналов Orai3-E165A (n = 7) приводила к увеличению селективности Ca 2+ и 20-кратному снижению тока, активируемого 2-APB. плотность (рис. 4, А – Д). Снижение плотности тока напоминает мутацию E165Q, которая также приводит к уменьшению активируемых 2-APB токов Orai3 (Schindl et al., 2008). Магазинные каналы Orai3-WT (n = 6) и Orai3-E165A (n = 5) были схожи по плотности тока (рис. 4, F – J). Кроме того, ни WT, ни мутантные каналы не показали увеличения амплитуды тока при замене раствора от 2 до 20 мМ Ca 2+ Ringer (рис.4, F – I). Предыдущие исследования показали, что как эндогенно экспрессируемые токи каналов CRAC (Bootman et al., 2001; Parekh and Putney, 2005), так и гетерологически экспрессируемые токи каналов Orai1 и dOrai, управляемые магазином (Yeromin et al., 2004; Zhang et al., al., 2008) удваивается по амплитуде при внешнем обмене раствора с 2 мМ до 6–20 мМ Ca 2+. Следовательно, удивительно, что аналогичный протокол обмена решениями не увеличивает амплитуду тока Orai3 с запоминающим устройством. Результат предполагает, что Orai3, управляемый магазином, не так селективен по Ca 2+, как Orai1 или dOrai.Еще один аспект накопительного тока Orai3-E165A, который следует отметить, — это увеличенная наружная составляющая, переносимая ионами цезия (Cs +; рис. 4, H – J). Это свойство тока не было неожиданностью, т.к. мутация гомологичного остатка E190 Orai1 в глутамин также придает повышенную проницаемость для Cs + (Prakriya et al., 2006; Vig et al., 2006b). Таким образом, мутация E165A резко ингибирует 2-APB-активированный, но не управляемый накоплением, ток Orai3. Этот результат согласуется с нашей более ранней гипотезой: остаток E165, который исключен из…

    Контекст 5

    … остатков, которые способствуют образованию поры Orai3, активированной 2-APB. Мы сосредотачиваемся на специфических остатках TM1, которые, как известно, выстилают поры каналов Orai1, управляемых хранилищами (McNally et al., 2009; Zhou et al., 2010). Затем мы исследуем TM3 E165, консервативный остаток TM3, который, как было показано, влияет на селективность Ca 2+ в Orai1, управляемом STIM1, и Orai3, активируемом 2-APB (Prakriya et al., 2006; Schindl et al., 2008). Мы показываем, что определенные мутанты цистеина TM1 и TM3 демонстрируют зависимую от состояния блокировку тока CdCl 2 и / или 2-аминоэтилметантиосульфонатом (MTSEA), и обсуждаем наши результаты в контексте опубликованной кристаллической структуры dOrai (Hou et al., 2012). Чтобы определить, участвуют ли остатки TM1, выстилающие управляемую магазином поры Orai1, в формировании поры Orai3, активируемой 2-APB, мы ввели мутации цистеина в гомологичные положения — Q83, E81, V77, G73, L70 и R66 — белка Orai3. Затем мы провели серию экспериментов, в которых сначала активировали эти мутантные каналы Orai3 с помощью 2-APB, а затем попытались заблокировать с помощью различных концентраций CdCl 2. Мы предположили, что электростатические взаимодействия между Cd 2+ и доступными сульфгидрильными группами введенных цистеинов внутри поры Orai3 могут привести к блокированию каналов.Во-первых, мы сравнили чувствительность к CdCl 2 в каналах WT и мутантного Orai3 и обнаружили, что каналам Orai3-WT требуются более высокие концентрации CdCl 2 для блокирования тока, активированного 2-APB (n = 10), чем для Orai3-Q83C (n = 4), Мутантные каналы Orai3-V77C (n = 6) и Orai3-L70C (n = 4). Типичные временные характеристики и соответствующие отношения I-V, взятые из экспериментов с блоком CdCl 2 для Orai3-WT, Orai3-Q83C, Orai3-V77C и Orai3-L70C, показаны на рис. 1 (A – H). Кривые доза-ответ CdCl 2 как для входящих, так и для внешних компонентов 2-APB-активированного тока Orai3-WT, Orai3-Q83C, Orai3-V77C и Orai3-L70C представлены на рис.1 (I и J) и показывают ток, остающийся после применения соответствующей концентрации CdCl 2. Эти кривые доза-ответ показывают, что мутации Q83C, V77C и L70C усиливают чувствительность к блокированию CdCl 2. Следовательно, остатки Q83, V77 и L70 участвуют в формировании поры Orai3, активируемой 2-APB. Мутантные каналы Orai3-E81C, Orai3-G73A, Orai3-G73C и Orai3-R66C не активировались при применении 2-APB во время экспериментов на целых клетках (плотности тока, активированные 2-APB, оставались значительно ниже 3 пА / пФ,> 100- раз меньше, чем плотность тока WT).Обработка восстанавливающим реагентом BMS во время активации 2-APB мутантных каналов Orai3-G73C и Orai3-R66C не увеличивала амплитуду тока. Этот результат, наряду с нефункциональными каналами G73A, предполагает, что мутации G73C и R66C изменяют чувствительность Orai3 к активации 2-APB или предотвращают образование проводящей поры. Отсутствие ответа на приложение 2-APB не является результатом блокады из-за образования межсубъединичного дисульфидного мостика, который может блокировать проводящий путь Orai3, активированный 2-APB.Эти данные суммированы на фиг. S1 в виде гистограмм, представляющих плотность тока, переносимую мутантами, по сравнению с каналами Orai3-WT. Реагенты MTS представляют собой тиол-реактивные зонды, которые взаимодействуют с доступным цистеинсульфгидрилом посредством ковалентной связи. Если реагент MTS ковалентно связывается с остатком цистеина в проводящем пути или поре ионного канала, проводимость канала блокируется до тех пор, пока взаимодействие не изменится на противоположное с использованием восстанавливающего реагента, такого как BMS. В нашей следующей серии экспериментов мы стремились протестировать Cd 2+ -чувствительные цистеиновые мутанты TM1, описанные в предыдущем разделе наших результатов, на блокировку положительно заряженными реагентами MTS.Мы обнаружили, что MTSEA (n = 3), MTSET (n = 3) и MTSEAE (n = 3) только обратимо блокировали активированные 2-APB каналы Orai3-WT (рис. 2, A и B; и рис. S2, А и Б). Следовательно, четыре эндогенных цистеина Orai3, два в TM2 и два в петле TM3-TM4, либо не реагировали с применяемыми реагентами MTS, либо не реагировали таким образом, чтобы приводить к необратимой блокировке каналов. Аналогичным образом, применение BMS приводит к частичному подавлению активированного 2-APB тока Orai3. Однако активированные 2-APB каналы Orai3-V77C вели себя иначе.Почти 80% тока через Orai3-V77C было заблокировано MTSEA (n = 3) и оставалось заблокированным после промывки. Амплитуды тока вернулись к норме только после последующего нанесения и смывания BMS. Кроме того, больший MTSET не блокировал ток через Orai3-V77C (n = 3; рис. 2, C и D). Чтобы проверить зависимость состояния блока MTSEA, мы применили MTSEA к каналам Orai3-V77C во время перфузии по Рингеру, а не во время активации 2-APB, и обнаружили, что это не привело к блокированию каналов (рис.2, E и F). Таким образом, только поры в открытом состоянии Orai3-V77C достаточно широки, чтобы позволить MTSEA, но не MTSET, проникнуть, ковалентно реагировать с введенным остатком цистеина и блокировать ток. Эти данные суммированы в виде гистограмм с точки зрения процента тока, остающегося после обработки реагентом MTS, с BMS или без него, на рис. 2 G. Наши данные показывают, что остаток V77 расположен внутри поры Orai3, активированной 2-APB, и что при мутации в цистеин его реакция с MTSEA образует пробку, которая непосредственно ингибирует проводимость.Наконец, как и каналы Orai3-WT, каналы Orai3-Q83C и Orai3-L70C были устойчивы к необратимой блокировке с помощью MTSEA, MTSET или MTSTEAE (рис. S2). В следующей серии экспериментов мы стремились проверить, является ли более селективная, управляемая магазином пора Orai3 физически уже, чем активированная 2-APB пора Orai3, используя MTSEA в качестве зонда. Магазинные каналы Orai3-WT выставили только реверсивную блокировку тока по MTSEA; при отмывке реагента токи возрастали до амплитуд, зарегистрированных до применения MTSEA (n = 3; рис.3, А и Б). Опять же, эндогенные цистеины Orai3 не реагировали с MTSEA или, по крайней мере, не реагировали таким образом, чтобы ингибировать проводимость. Однако, к нашему удивлению, ток Orai3-V77C, управляемый магазином, блокировался MTSEA и оставался заблокированным после смывания реагента (n = 8). Амплитуды тока Orai3-V77C вернулись к норме только после применения BMS (рис. 3, C и D). В целом, в среднем 55% потребляемого магазином тока через каналы Orai3-V77C было заблокировано приложением MTSEA (рис. 3 E).Хотя MTSEA блокирует больший процент активированного 2-APB тока Orai3 (≥80%), наши данные предполагают, что остаток V77 принимает непосредственное участие в образовании как 2-APB-активируемого, так и управляемого хранилищем (STIM1-активированного) Orai3 поры. Возможно, большая степень блокирования, проявляемого во время активации 2-APB, в отличие от активации, индуцированной STIM1, может быть объяснена большим диаметром расширенной 2-APB-активируемой поры Orai3. В следующей серии экспериментов мы стремились определить роль остатка Orai3 TM3 E165 в порообразовании.Как обсуждалось во введении, было показано, что E165 и его гомолог E190 Orai1 влияют на селективность по Ca 2+ и стробирование 2-APB (Prakriya et al., 2006; Vig et al., 2006a; Yamashita et al., 2007; Schindl. и др., 2008). Более того, хорошо установлено, что 2-APB активирует каналы Orai3 за счет расширения пор (Schindl et al., 2008). Мы предположили, что расширение пор с помощью 2-APB может позволить E165 двигаться к центральной оси или поре канала и, таким образом, взаимодействовать с поступающими ионами. Каналы Orai3, управляемые магазином, не расширены; следовательно, мы ожидали, что E165 будет играть меньшую роль в формировании управляемой хранилищем поры Orai3 и, следовательно, не будет взаимодействовать с поступающими ионами во время индуцированной STIM1 активации Orai3.Чтобы проверить эту гипотезу, мы нейтрализовали остаток и предположили, что удаление отрицательного заряда может снизить плотность тока, активированную 2-APB, но не управляемую накопителем. На первый взгляд, активированные 2-APB каналы Orai3-WT и Orai3-E165A кажутся схожими с точки зрения ионной селективности; оба проводят неселективные катионные токи, которые имеют внутреннюю и внешнюю выпрямляющую форму ВАХ. Однако по сравнению с Orai3-WT, активированным 2-APB (n = 7), экспрессия каналов Orai3-E165A (n = 7) приводила к увеличению селективности Ca 2+ и 20-кратному снижению тока, активируемого 2-APB. плотность (рис.4, А – Д). Снижение плотности тока напоминает мутацию E165Q, которая также приводит к уменьшению активируемых 2-APB токов Orai3 (Schindl et al., 2008). Магазинные каналы Orai3-WT (n = 6) и Orai3-E165A (n = 5) были схожи по плотности тока (рис. 4, F – J). Кроме того, ни WT, ни мутантные каналы не демонстрируют увеличения амплитуды тока при замене раствора от 2 до 20 мМ Ca 2+ Ringer (рис. 4, F – I). Предыдущие исследования показали, что оба эндогенно экспрессируются токи канала CRAC (Bootman et al., 2001; Parekh and Putney, 2005) и гетерологически экспрессируемые токи в каналах Orai1 и dOrai, управляемые магазином (Yeromin et al., 2004; Zhang et al., 2008), удваиваются по амплитуде при внешнем обмене раствором с 2 мМ до 6–20 мМ Ca 2+. Следовательно, удивительно, что аналогичный протокол обмена решениями не увеличивает амплитуду тока Orai3 с запоминающим устройством. Результат предполагает, что Orai3, управляемый магазином, не так селективен по Ca 2+, как Orai1 или dOrai. Еще один аспект накопительного тока Orai3-E165A, который следует отметить, — это увеличенная наружная составляющая, переносимая ионами цезия (Cs +; рис.4, H – J). Это свойство тока не было неожиданностью, т.к. мутация гомологичного остатка E190 Orai1 в глутамин также придает повышенную проницаемость для Cs + (Prakriya et al., 2006; Vig et al., 2006b). Таким образом, мутация E165A резко ингибирует 2-APB-активированный, но не управляемый накоплением, ток Orai3. Этот результат согласуется с нашей более ранней гипотезой: остаток E165, который исключен из управляемой запасами поры Orai3, может входить и способствовать образованию расширенной поры канала Orai3, активируемого 2-APB.Чтобы дополнительно проверить, участвует ли остаток E165 в формировании поры Orai3, активированной 2-APB, или разрешено ли ему перемещаться к центральной оси канала во время индуцированной 2-APB дилатации, где он может взаимодействовать с …

    Статус приложения SSC MTS — проверка статуса приложения по зоне

    Ссылка для проверки статуса приложения SSC MTS скоро будет доступна. Экспертиза ГНЦ МТС в ближайшее время проведет кадровая комиссия. Кандидатам, желающим подать заявку на предстоящий экзамен SSC MTS для набора нетехнических должностей многозадачного персонала, необходимо проверить, принято или отклонено их заявление соответствующим экзаменационным органом (Комиссией по отбору персонала).

    Чтобы проверить то же самое, кандидаты могут действовать двумя способами. Во-первых, они могут перейти по ссылке из различных региональных зон SSC, чтобы проверить статус своей заявки со своего веб-сайта, выполнив шаги, упомянутые в этой статье, или они могут просто выполнить шаги, указанные ниже, чтобы проверить статус своей заявки в SSC MTS. экспертиза.

    Начните подготовку к экзамену с Live Coaching SSC MTS Testbook Select здесь.

    SSC MTS Статус приложения Ключевые точки

    Кандидатам, желающим проверить статус заявки, необходимо знать несколько ключевых моментов, касающихся экзамена SSC ​​MTS 2021.

    Обзор экзамена SSC ​​MTS 2021

    Exam Conducting Body

    Комиссия по отбору персонала

    Название экзамена

    Экзамен многозадачного персонала (группа C) Комиссии по отбору персонала или экзамен SSC MTS

    Режим приложения

    Онлайн

    Название сообщения

    Многозадачный персонал (группа C)

    Количество статей

    Официальный сайт

    Официальный сайт SSC

    SSC MTS Zone Wise Application Status Link

    Ниже кандидаты могут найти ссылку на статус заявки зоны на экзамен SSC MTS 2021.

    Зона

    Ссылка на статус приложения (ссылки будут активированы в ближайшее время)

    ГЮК Восточный регион

    Нажмите здесь

    SSC Karnataka Kerala Region

    Нажмите здесь

    ГНЦ Северо-Восточный регион

    Нажмите здесь

    SSC, Мадхья-Прадеш, регион

    Нажмите здесь

    ГНЦ Центральный регион

    Нажмите здесь

    ГНЦ Северо-Западный регион

    Нажмите здесь

    SSC Северный регион

    Нажмите здесь

    Претенденты могут проверить здесь, чтобы узнать, как загрузить SSC MTS Admit Card

    Как проверить статус заявки на экзамен SSC MTS 2021? Кандидаты

    могут выполнить пошаговую процедуру, описанную ниже, чтобы легко проверить статус заявки на экзамен SSC MTS 2021.

    Прямая ссылка для проверки статуса приложения SSC MTS

    (Примечание: ссылка будет активирована в ближайшее время)

    • Шаг 1: Посетите официальный сайт соответствующей зоны Комиссии по отбору персонала, щелкнув по ссылкам выше.
    • Шаг 2: В раскрывающемся меню найдите и щелкните ссылку «Статус приложения» экзамена SSC ​​MTS
    • Шаг 3: Теперь на следующей странице, если вы знаете детали регистрационного номера / номера рулона, нажмите «Да» и введите данные для поиска статуса вашего приложения.
    • Шаг 4: Если вы не знаете регистрационный номер / номер рулона, нажмите «Нет».
    • Шаг 5: Теперь введите такие данные, как имя, имя матери, дату рождения и т. Д.
    • Шаг 6: Нажмите «Статус поиска», чтобы узнать статус приложения.
    • Шаг 7: Статус приложения будет отображаться на экране

    Примечание. Шаги 4–7 предназначены только для тех кандидатов, которые не знают свой регистрационный номер / номер рулона. Если вы знаете эти данные, то статус приложения будет отображаться после шага 3.

    Кандидаты могут проверить критерии соответствия SSC MTS

    Распространенные причины отклонения заявки

    Теперь есть определенные причины, по которым орган, проводящий экзамен, может отклонить заявку.Ниже приведены некоторые из распространенных причин отклонения формы заявки на экзамен SSC MTS 2021.

    1. Несоблюдение надлежащих инструкций при заполнении формы заявки может быть основной причиной отклонения заявки на экзамен SSC MTS 2021.
    2. Предоставление неверной информации в форме заявки также является очень частой причиной отклонения формы заявки.
    3. Другая причина — уплата регистрационного сбора или его неуплата.Кандидаты всегда должны проверять статус пошлины за подачу заявки после оплаты формы заявки. Неуплата должным образом пошлины за подачу заявки может быть частой причиной отклонения формы заявки в SSC MTS.
    4. Другой распространенной причиной отклонения формы заявки SSC MTS является несоблюдение критериев допуска к экзамену SSC MTS. Кандидаты должны ознакомиться со всеми подробностями о праве на участие, такими как национальность, возрастной предел, минимальный образовательный уровень, количество попыток и так далее.
    5. Последняя распространенная причина — неправильная загрузка документов при заполнении анкеты. Кандидаты из зарезервированных категорий должны это отметить. Очень необходимо загрузить соответствующие документы. Кандидаты также должны следовать предписанному формату и инструкциям по загрузке изображения и подписи, если они не хотят, чтобы их форма заявки была отклонена.

    Мы надеемся, что вы нашли эту статью информативной и полезной, и, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам с любыми сомнениями или вопросами относительно статуса заявки SSC MTS 2021.Вы также можете загрузить приложение Testbook, которое является абсолютно бесплатным, и начать подготовку к экзамену SSC MTS 2021 или любому государственному конкурсному экзамену, пройдя пробные тесты перед экзаменом, чтобы повысить свою подготовку.

    Также ознакомьтесь с процессом выбора SSC ​​MTS

    Полиамины и гипусинация eIF5A модулируют дыхание митохондрий и активацию макрофагов

    Основные моменты

    Путь синтеза полиаминов и гипусинирование eIF5A модулируют митохондриальный цикл OXPHOS

    ETC

    ETC в макрофаге

    Эффективная экспрессия некоторых митохондриальных ферментов зависит от eIF5A H

    Ингибирование гипусинированного eIF5A притупляет альтернативную активацию макрофагов

    Каким образом клетки адаптируются к активной области метаболизма представляет интерес по биологии.Среди широкого спектра функций, полиамин-спермидин необходим для гипусинирования фактора трансляции, эукариотического фактора инициации 5A (eIF5A). Мы показываем здесь, что гипусинированный eIF5A (eIF5A

    H ) способствует эффективной экспрессии подмножества митохондриальных белков, участвующих в цикле TCA и окислительном фосфорилировании (OXPHOS). Некоторые из этих белков имеют митохондриальные нацеленные последовательности (MTS), которые частично обеспечивают повышенную зависимость от eIF5AH. В макрофагах метаболическое переключение между OXPHOS и гликолизом поддерживает различные функциональные судьбы, стимулируемые сигналами активации.В этих клетках гипусинирование eIF5A, по-видимому, динамически регулируется после активации. Используя модели in vivo, и in vitro, , мы показали, что острое ингибирование этого пути притупляет OXPHOS-зависимую альтернативную активацию, оставляя неизменной классическую активацию, зависимую от аэробного гликолиза. Эти результаты могут иметь значение для терапевтического контроля активации макрофагов путем нацеливания на ось полиамин-eIF5A-гипузин.

    Ключевые слова

    иммунометаболизм

    гипусинация

    eIF5A

    дезоксигипузинсинтаза

    дезоксигипузин-гидроксилаза статей

    активация макрофагов

    статей о метаболизме

    Опубликовано Elsevier Inc.

    Рекомендуемые статьи

    Цитирующие статьи

    Хостинг и реклама Survival Evolved Server

    MTSArk TrioTribes [5x / PvP / OfflineTurretDamageX4] 3300+ участников сообщества и создателей контента

    БОЛЬШЕ, ЧЕМ ВЫЖИВШИЕ


    Добро пожаловать MoreThanSurvivors Ark. MTS — одно из крупнейших сообществ Ark PvP по состоянию на февраль 2018 года. Мы запускаем минималистичные моды для улучшения качества жизни, чтобы сохранить ощущения ванили такими же, как в оригинальной игре — у нас есть уникальный Кластер серверов игрового режима со специальным лимитом 3ManTribe, 3-кратным сопротивлением конструкции и 3-кратной защитой от урона от турелей в автономном режиме.Мы также предлагаем сбалансированный набор правил, в котором мы полны решимости обратиться ко всем игрокам, как начинающим, так и тем, кто хочет играть против игрока.

    Если это похоже на то, как вы хотите играть в Ark: Survival Evolved, значит, вы нашли подходящее сообщество.

    Добро пожаловать.

    ✮ Discord ✮

    https://discord.gg/bjcgjPW (более 3300+ участников сообщества)

    ✮ Информация о присоединении к серверу ✮


    RAGNAROK
    — IP-адрес сервера: 145.239.205.67: 27015
    — Порт: 7777
    — Battlemetrics: https://www.battlemetrics.com/servers/ark/3446557
    — Ark-Servers.net: https://ark-servers.net/server/174361 /
    — Ссылка для присоединения: steam: //connect/145.239.205.67: 27015

    ABERRATION
    — IP-адрес сервера: 145.239.205.67:27018
    — Порт: 7783
    — Battlemetrics: https: //www.battlemetrics. com / servers / ark / 3449996
    — Ark-Servers.net: https://ark-servers.net/server/174362/
    — Ссылка для присоединения: steam: // connect / 145.239.205.67: 27018

    THE ISLAND
    — IP-адрес сервера: 145.239.205.67:27017
    — Порт: 7781
    — Battlemetrics: https://www.battlemetrics.com/servers/ark/3449994
    — Ark -Servers.net: https://ark-servers.net/server/174364/
    — Ссылка для присоединения: steam: //connect/145.239.205.67: 27017

    EXTINCTION
    — IP-адрес сервера: 145.239.205.67 : 27016
    — Порт: 7779
    — Battlemetrics: https://www.battlemetrics.com/servers/ark/3450009
    — Ark-Servers.сеть: https://ark-servers.net/server/174363/
    — Ссылка для присоединения: steam: //connect/145.239.205.67: 27016

    ЦЕНТР
    — IP-адрес сервера: 145.239.205.67:27019
    — Порт: 7785
    — Battlemetrics: https://www.battlemetrics.com/servers/ark/3505750
    — Ark-Servers.net: https://ark-servers.net/server/175327/
    — Присоединиться по ссылке : steam: //connect/145.239.205.67: 27019

    ✮ Настройки ✮


    Режим = PvP
    Лимит племени = 3
    Максимальный уровень игрока = 105
    Максимальный уровень диких динозавров = 150
    Максимальный уровень яйца диких виверн = 190
    Макс.уровень дикого скального дракона = 190
    Дневная скорость = 0.5 (Аберрация = 1,0)
    Скорость в ночное время = 1,5 (Аберрация = 1,0)
    Опыт = 5,0
    Сбор урожая = 5,0
    Приручение = 5,0
    Рост урожая = 5,0
    Урон пещеры = 6,0
    Потребление еды / воды игроком = 0,5
    Добыча с маяка Качество = 1,0
    Качество добычи = 1,2
    PlayerFortitudePerLevelStatsMultiplier = 5,0
    PerPlatformMaxStructuresMultiplier = 0,45
    Разведение = 5,0
    Вывод из яиц = 5,0
    Созревание ребенка = 5,0
    Интервал спаривания = 0,5
    Интервал отпечатка ребенка = 0.5
    Tribemate Imprints = True
    Unlimited Mindwipe Respecs = True
    Diseases = False
    Alliance System = False
    Custom Recipes = True
    Corpse Locater = True
    Console Gamma = True
    Auto Unlock Engrams = True
    Show Floating Damage Admin = False
    Show Floating Damage Admin = False Ведение журнала = True
    S + Nanny Imprint Assist = 50%
    Перенос кластера = True
    Таймеры передачи = False

    ✮ Система ORP ✮


    — Когда ваш последний член племени выходит в автономный режим, запускается 30-минутный таймер.
    — Когда этот таймер достигает 0, ВСЕ ваши постройки получают в три раза меньше урона (StructureResistance = 0,33), а ваши турели наносят тройной урон (StructureDamage = 3,0).
    — Все прирученные дино все еще могут быть повреждены и подобраны летунами во время активного ORP.
    — Нет полной автономной защиты от рейдов, и рейды все еще возможны, когда племя не в сети, однако это намного сложнее.
    — Когда член племени входит в систему, есть 30-секундный таймер, пока сопротивление строению и урон не будут сброшены до значения по умолчанию 1.0.
    — Максимальное время ОВП составляет 120 часов (5 дней).
    — После того, как племя было оффлайн в течение 168 часов (7 дней), его структуры автоматически разлагаются, и их динозавры становятся невостребованными.

    ✮ Моды ✮


    Structures Plus +
    HG Stacks 1000-90
    SelVision
    Offline Guard System
    Редактируемый пользовательский интерфейс сервера (WBUI)

    https://steamcommunity.com/sharedfiles/filedetails/?id=1726224384

    Untameable Creatures ✮


    Managarmr
    Griffin
    Titanosaur
    Ice Titan
    Desert Titan
    Forest Titan

    ✮ Правила сервера ✮


    (1) Общие правила

    1.1 Английский только в мире.
    1.2 Не должно быть никаких обвинений в злоупотреблениях со стороны администратора, вход в систему администратора включен по какой-то причине, и если у кого-то есть опасения по этому поводу, обратитесь напрямую к Гамильтону (Владельцу).
    1.3 Убедитесь, что вы не совершаете каких-либо неправомерных действий. Не пытайтесь установить диктатуру, шантажировать других, создавать токсичность и разрушать игру для других игроков в сообществе. Это включает, но не ограничивается языком, который является незаконным, вредным, угрожающим, оскорбительным, оскорбляющим, дискредитирующим, вульгарным, непристойным, ненавистным, откровенно сексуальным или оскорбительным по расовому, этническому или иным признакам.Это PvP, пустые разговоры — это нормально, но если это выйдет из-под контроля, ситуация будет пересмотрена и рассмотрено соответствующим образом.
    1.4. Вы не можете раскрывать местонахождение баз других племен в Глобальном чате или в Discord, однако вы можете делиться этой информацией в частном порядке.
    1.5 У вас должно быть действительное имя персонажа. Вы не можете называть своего персонажа «Человек», «Выживший», «Игрок», «123», «□□□» или что-то подобное.

    (2) Правила сервера

    2.1 Все сооружения, которые вы размещаете, должны быть видимыми и устойчивыми к повреждению.
    2.2 Не «сажайте» офлайновых игроков.
    2.3 Правила строительства: Не закрывайте доступ к следующим достопримечательностям, не строите на них или рядом с ними; Обелиски и городские терминалы, портал (юго-запад), наземные входы в Аберрации, пещеры артефактов.
    2.4 Отсутствие объединения, это включает в себя смену членов племени на вход / выход для поддержания намерений и духа сервера TrioTribe. Разрешено объединение PvE-команд в таких событиях, как боссы или орбитальные поставки. Однако игрокам не разрешается создавать неформальные союзы между племенами, когда дело доходит до PvP.Сюда входят такие вещи, как; Совместные набеги на одно или несколько племен (6 на 3 и т. Д.), Защита племени от атак других племен для обеспечения взаимной защиты.
    2.5 Инспекция полностью запрещена, это означает выход из племени и забрать ценности, которыми вы лично не владеете, без согласия племени.

    (3) Правила PVP

    3.1 Турели или F.O.B могут быть построены в мире во время рейдов, PvPing, PvEing или при телепортации на арены с боссами через терминалы. Но должны быть сняты сразу после выхода из зоны и не должны быть оставлены в мире.
    3.2 Если вы подвергаетесь или собираетесь подвергнуться нападению, вы не можете записать боевой журнал (немедленно выйти из системы), чтобы активировать таймер активации ORP. Если вы хотите выйти из системы во время рейда, обратитесь к администратору, который установит время для завершения рейда.
    3.3 Не сжигайте добычу, это означает, что предметы из вашего инвентаря должны исчезнуть. Это включает в себя нежелательную добычу из рейдов или сброс всей ценной добычи, когда вам грозит неминуемая смерть. Если вы случайно перегружаете себя, вы должны отбросить все и извлечь нужные предметы из кеша сброшенных предметов.

    Любые ловушки для приручения, шипы, заброшенные базы, неактивные FOB, чрезмерный спам Foundation, обнаруженные в мире, будут удалены администратором без предупреждения.

    ✮ Тарифы на выходные ✮


    Приручение = 5.0 → 10.0
    Качество добычи = 1.0 → 1.2

    Суббота 00.00 — воскресенье 12:00. (48 часов)

    ✮ Удаленные энграммы ✮


    Все элементы S + TEK
    Все башни S +
    Все стены S + Large и XL
    Все внутренние трубы S +
    Все опоры S + ограждения
    Все S + Динамические стойки
    S + Ремонтный пистолет
    S + Ремонтный пистолет Light Setter
    S + Пистолет для эвтаназии
    S + Подводный инструмент
    S + Пульт дистанционного управления
    S + Инструмент управления
    S + Инвентарь
    S + Овцевод
    S + Персональный телепорт
    S + Манекен
    S + Создатель чертежей
    S + Зарядный инжектор S + Зарядная пластина
    S + Auto Станция
    S + Кровать
    S + Двухъярусная кровать
    S + Электрический генератор
    Пивная бочка (Bug Exploit)
    Деревянный стул (Противоречие с сеткой)
    Спальный мешок (Противоречие с сеткой)

    ✮ S + Настройки мода ✮


    ChemistrySpeedator = 3CraftingSpeed
    ForgeCraftingSpeed ​​= 2
    GrinderCraftingSpeed ​​= 8
    IndustrialForgeCraftingSpeed ​​= 2
    IndustrialGrillCraftingSpeed ​​= 2
    Mo rtarAndPestleCraftingSpeed ​​= 2
    SmithyCraftingSpeed ​​= 2
    SPlusCraftingStationCraftingSpeed ​​= 2
    AllowIntakeToPlaceWithoutWater = True
    DisableAbilityToHideStructures = True
    NannyMaxImprint = 50 0730.5
    DisablePickupWhenDamaged = true
    VaultSlotCount = 500

    ✮ Серверные плагины ✮


    Все энграммы
    Ark Advert
    Ark Shop
    Пользовательский чат
    Улучшенные команды
    Лотерея
    Голосовать за ORP
    Список разрешений
    Новый игрок
    Тарифы на выходные

    ✮ В игровом магазине ✮


    Вы зарабатываете очки каждые 30 минут игры на сервере;
    — Игроки по умолчанию зарабатывают 25 очков.
    — VIP-донаторы зарабатывают 50 баллов.
    — Игроки могут заработать дополнительные очки, убивая альфа-существ в мире.

    / купить 01 (Цена: 500) = 1x Пустой криопод
    / купить 02 (Цена: 2000) = 1x Криохолодильник
    / купить 03 (Цена: 250) = Mindwipe (24 часа восстановления)
    / купить 04 (Цена: 400) = 1x пивная банка
    / покупка 05 (цена: 400) = навозный жук, уровень 75
    / покупка 06 (цена: 400) = ахатина, уровень 75
    / покупка 07 (цена: 400) = S + домашний улей
    / покупка 08 (цена: 50) = 2x каждого красителя
    / купить 09 (Цена: 100) = Базовый корм x3
    / купить 10 (Цена: 200) = Простой корм x3
    / купить 11 (Цена: 300) = Обычный корм x3
    / купить 12 (Цена: 400) = Superior Kibble x3
    / купить 13 (Цена: 500) = Exceptional Kibble x3
    / купить 14 (Цена: 600) = Extraordinary Kibble x3
    / купить 15 (Цена: 150) = ARKaeology Skins
    / купить 16 (Цена: 200) = Разблокировать все прически
    / купить 17 (Цена: 200) = Разблокировать все прически для лица

    ✮ Пожертвования ✮


    More Than Survivors — одно из крупнейших неофициальных сообществ Ark: Survival Evolved.Сообщество нашего масштаба имеет очень большую и дорогую инфраструктуру, где оно полагается на людей, которые играют, чтобы поддержать его финансово. Наша установка состоит из мощных выделенных серверов, которые обеспечивают плавную, надежную и бесперебойную работу, что, мы надеемся, вы все оцените, поскольку это редко встречается с большими серверами Ark. Пожертвования помогают нам покрывать наши ежемесячные расходы и помогают МТС жить, расти и совершенствоваться.

    Мы надеемся, что ваше пожертвование сделано с единственной целью — развлечься на MTSArk, и вы цените отсутствие механики P2W для создания наилучшего возможного опыта PvP.

    Сумма пожертвований полностью зависит от игроков; Жертвователи на сумму более 20 фунтов стерлингов получат

    — двойные баллы в магазине (50 баллов за 30 минут).
    — приоритетный доступ к белому списку для обхода очередей для вашей домашней карты.
    — VIP-рейтинг в Discord.
    — 5x Dino Paint (Раскрасьте динозавров на ваше усмотрение, цвета привязаны к леске, поэтому их можно передавать при разведении).

    Посмотрите видео от создателей контента, воспроизводимых на сервере!

    ✮ KISHKO ✮

    https: // www.youtube.com/watch?v=-1Dj-sVvoGM

    ✮ The Apex Way ✮

    https://www.youtube.com/watch?v=grrafJ8iNqQ

    ✮ BAM ✮

    https://www.youtube .com / watch? v = u8XIOitl0tc & t = 0s

    ✮ EXFIB0 ✮

    https://www.youtube.com/watch?v=7-f10576Sk8&feature=youtu.be&list=LLtz1f9QiMeP-2XY4000 0007 0007 28L 9QvL

    0007 28L : //www.youtube.com/watch? v = PMql2q8ovUs & t = 0s

    ✮ SEAASER ✮

    https://youtu.be/IZH7F_N4FN4

    ✮ Lucky by Nature ✮

    https: // www.youtube.com/watch?v=L9gInuapIwU&t=0s

    Определение заказа (MTO)

    Что такое «Сделать заказ» (MTO)?

    Изготовление на заказ (MTO) или изготовление на заказ — это производственная бизнес-стратегия, которая обычно позволяет потребителям приобретать продукты, адаптированные к их спецификациям. Это производственный процесс, в котором производство товара начинается только после получения подтвержденного заказа от клиента. Это также известно как массовая настройка.

    Ключевые выводы

    • Изготовление на заказ (MTO) или изготовление на заказ — это производственная бизнес-стратегия, которая обычно позволяет потребителям приобретать продукты, адаптированные к их спецификациям.
    • Процесс производства элемента MTO начинается только после получения подтвержденного заказа клиента.
    • Преимущества MTO включают настройку для клиентов, сокращение устаревания запасов и запасов готовой продукции, а также общий объем отходов.
    • Недостатки MTO включают повышенные затраты и увеличенное время ожидания готового продукта.
    • MTO можно противопоставить производству на складе (MTS), когда запасы производятся до того, как потребители покупают их с полки.

    Общие сведения об изготовлении заказа (MTO)

    Стратегия изготовления на заказ (MTO) означает, что фирма производит конечный продукт только после того, как клиент разместит заказ, создавая дополнительное время ожидания для потребителя, чтобы получить продукт, но позволяя более гибкую настройку по сравнению с покупкой непосредственно у полки розничных продавцов.

    Этот тип производственной стратегии называется операцией цепочки поставок тянущего типа, потому что продукция производится только тогда, когда есть устойчивый потребительский спрос.Модель производства прицепного типа используется в сборочной промышленности, где количество, необходимое для производства в соответствии со спецификацией продукта, составляет одно или несколько. Сюда входят специализированные отрасли, такие как строительство, производство самолетов и судов, мосты и так далее. MTO также подходит для продуктов с высокой степенью конфигурации, таких как компьютерные серверы, автомобили, велосипеды или продукты, хранение которых очень дорого обходится.

    Чтобы управлять уровнями запасов и обеспечивать повышенный уровень настройки, некоторые компании применяют производственную систему «изготовление на заказ».Стратегия MTO устраняет проблемы избыточных запасов, которые характерны для традиционной стратегии производства на склад. Dell Computers — это пример бизнеса, использующего производственную стратегию MTO, при которой клиенты могут заказать полностью настроенный компьютер через Интернет и получить его через пару недель.

    Основным преимуществом системы MTO является возможность выполнить заказ с точной спецификацией продукта, требуемой заказчиком. Скидки от продаж и запасы готовой продукции также сокращаются, а устаревание запасов контролируется.Однако, чтобы система MTO была успешной, она должна сочетаться с упреждающим управлением спросом. Также следует учитывать, что система MTO подходит не для всех типов продуктов.

    Связанный с MTO — это сборка на заказ (ATO), которая представляет собой бизнес-производственную стратегию, при которой продукты, заказываемые клиентами, производятся быстро и в определенной степени настраиваются. Стратегия сборки на заказ (ATO) требует, чтобы основные части продукта уже были изготовлены, но еще не собраны.После получения заказа детали быстро собираются и отправляются заказчику.

    Производство на заказ (MTO) и изготовление на склад (MTS)

    Традиционные производственные методики производят продукты и хранят их в качестве запасов до тех пор, пока их не купит покупатель. Это известно как «изготовление на склад» (MTS). Однако эта система может быстро изнашиваться и устаревать, поскольку запасы находятся на полках в ожидании покупки. Эта проблема особенно остро стоит в такой отрасли, как технологии, где темп развития быстр и может быстро возникнуть проблема устаревших запасов.

    Теоретически метод MTS — отличный способ для компании подготовиться к увеличению или уменьшению спроса. Однако данные о запасах и, следовательно, объем производства выводятся путем создания прогнозов будущего спроса на основе прошлых данных.

    Существует высокая вероятность того, что прогнозы будут ошибочными, даже если они будут незначительными, а это означает, что компания может застрять с слишком большими запасами и слишком низкой ликвидностью. Это главный недостаток метода производства МТС. Неточные прогнозы приведут к убыткам из-за избыточных запасов или дефицита, а в быстро развивающихся секторах, таких как электроника или компьютерные технологии, избыточные запасы могут быстро устареть.

    Ограничения на оформление заказа (MTO)

    Два основных недостатка индивидуального управления заказом — это своевременность и стоимость настройки. Если продукты уже есть на полке, как в случае с MTS, то покупателю не нужно ждать, пока продукт будет изготовлен, собран и доставлен в соответствии со спецификацией. Стоимость также является фактором; готовые и доступные продукты одинаковы, поэтому производственные затраты снижаются за счет экономии на масштабе. Изготовление на заказ будет, как правило, более дорогим для потребителя, поскольку включает в себя детали и отделку, которые можно изменить.

    .