Отзывы клиентов, вопросы и ответы

Остановите колпачок! »МТС (Манитоба)

Правда или последствия: способствует ли приватизация государственной телефонной компании инновациям и эффективности или же обогащает горстку руководителей и акционеров за счет обслуживания клиентов? Две практически равноправные телефонные компании, обслуживающие канадские прерии, предлагают полезные идеи.

На заре 1900-х годов «солнечный путь» премьер-министра сэра Анри Чарльза Уилфрида Лорье и его либеральной партии заключался в том, чтобы раздвинуть западные границы и проложить новые железные дороги через Канаду.Отчасти рвение к расширению было вызвано чувством роста и оптимизма, но были также повсеместные опасения, что без значительных поселений в центральной Канаде американцы могут в конечном итоге аннексировать огромные участки пустых канадских сельскохозяйственных земель в своих собственных интересах.

Чтобы предотвратить это и укрепить свою национальную идентичность, Канада распахнула двери для иммиграции, особенно для трудолюбивых американцев со Среднего Запада, которые были засыпаны спонсируемой правительством рекламой о новой жизни и возможностях, которые поджидали канадские прерии.

Поход сработал. Между 1901 и 1906 годами население Саскачевана увеличилось с 91 279 до 257 763 человек, из которых 86,8% поселились в сельских сельскохозяйственных районах. К 1911 году население снова почти удвоилось и составило 492 432 человека, причем более 80% населения находилось вдали от городов Реджайна и Саскатун. По соседству в Манитобе многие новые жители предпочитали районы к югу от Виннипега, ближе к американской границе.

Неудивительно, что телекоммуникационная инфраструктура Канады (вместе с более чем несколькими новыми городами) вырастет вдоль железнодорожных линий.

Поскольку Bell Canada была занята расширением своей клиентской базы в Онтарио и Квебеке, правительства Манитобы и Саскачевана создали провинциальные государственные телефонные компании, чтобы взять под свой контроль свое будущее телекоммуникаций. В 1908 году появилась компания Manitoba Telephone System (MTS), состоящая в основном из бывших клиентов Bell.В 1909 году SaskTel также была основана как государственная компания, в которую снова входили бывшие клиенты Bell в провинции. И МТС, и СаскТел быстро выкупили все оставшиеся частные телефонные компании, все еще работающие в их среде.

Winnipeg Free Press отмечает, что и МТС, и SaskTel успешно обслуживали своих клиентов в течение почти 90 лет. В 1997 году премьер-министр Манитобы от прогрессивных консерваторов Гэри Филмон нарушил свое обещание не допускать участия МТС и приватизировал компанию, заявив, что в частных руках она будет более инновационной.

Этот шаг не повторится в Саскачеване, где каждая действующая политическая партия обычно считала SaskTel священным для экономического развития провинции. Даже консервативная партия Саскачевана, которая находилась у власти в провинции с 1982 по 1991 год, так и не удосужилась приватизировать телефонную компанию, и обещание приватизировать королевские корпорации в ближайшем будущем было лишь одним из нескольких вопросов, которые привели к краху партии. выборы 1991 года.

«Между тем, SaskTel, похоже, сосредоточен на обслуживании клиентов и их удовлетворении, будучи хорошим работодателем и предоставляя прибыль своему публичному акционеру: народу Саскачевана», — говорится в заключении Winnipeg Free Press .

Доказательства этичности обслуживания SaskTel можно было найти на прошлой неделе, когда SaskTel был признан самым надежным оператором беспроводной связи в Западной Канаде, согласно новому исследованию исследователя рынка Дж.D. Мощность.

«SaskTel занимает первое место по общему качеству сети и особенно хорошо работает по качеству звонков, сообщений и данных», — говорится в отчете J.D. Power.

SaskTel никогда не скупился на свои достижения, особенно на успех в предоставлении инновационных услуг в малонаселенных регионах Саскачевана:

• SaskTel была первой телекоммуникационной компанией в Канаде, которая завершила свою программу обслуживания индивидуальных линий в сельских районах, устранив все телефонные линии в 1990 году;
• SaskTel был в авангарде предоставления Интернета, первым в Канаде отменившим плату за междугородную связь с коммутируемым доступом в Интернет, и первым в Северной Америке, предложившим высокоскоростные услуги по телефонным линиям с помощью технологии DSL;
• SaskTel был одним из первых коммерческих пользователей волоконной оптики в мире, предлагая сегодня клиентам конкурентоспособные услуги кабельного телевидения, широкополосного доступа и телефонной связи.

Филмон

МТС не оказалась новатором, как обещали быть частной компанией. В то время как SaskTel становился мировым лидером в конвергентных оптоволоконных сетях, предоставляя голос, данные и видео по оптоволоконной линии, МТС повышала тарифы на абонентов фиксированной связи.

Сегодня основная стационарная связь в Саскачеване стоит около 8 долларов в месяц — на 27% меньше, чем самая дешевая домашняя телефонная связь МТС. В МТС все обычно стоит дороже, и это оказалось очень хорошо для акционеров и руководителей.Хотя МТС получает примерно вдвое большую прибыль, чем SaskTel, почти вся прибыль идет основным акционерам и топ-менеджерам. За последние пять лет SaskTel вернула правительству провинции, а также клиентам 497 миллионов долларов в виде ежегодной выплаты дивидендов. В Манитобе МТС продемонстрировала новаторский подход в избежании налоговых счетов — платит корпоративные налоги только один раз в 10 лет — а в 2010 году эта сумма составила всего 1,2 миллиона долларов. Креативный бухгалтерский учет в МТС позволил прибыльной компании платить «большой жирный ноль». в федеральном и провинциальном подоходном налоге », — сообщает газета, и МТС не ожидает, что получит ни копейки по подоходному налогу не раньше 2020 года.

Так куда же девается прибыль МТС? В прошлом году бывший генеральный директор МТС Пьер Блуэн получил компенсацию в размере 7,8 миллиона долларов, что намного выше его среднего показателя за пять лет в 4,8 миллиона долларов. Заработная плата Блуэна была более чем в 10 раз выше, чем ежегодно получает генеральный директор SaskTel.

Газета добавляет, что директорам МТС платят более чем в 10 раз больше, чем директорам SaskTel. Но что еще более тревожно, у человека, который сделал «Деньги» возможным для МТС, — бывшего премьер-министра Гэри Филмона — был уютный, хорошо оплачиваемый дом, который ждал его в совете директоров МТС после того, как он проиграл свою заявку на переизбрание.Он использовал свое время в МТС, чтобы устроить себе гнездо, получив более 1,4 миллиона долларов в виде гонораров и компенсаций за 10 лет, а также акций на сотни тысяч долларов.

«Ничто из этого не означает, что SaskTel является идеальной компанией, но совершенно очевидно, что эта государственная и управляемая компания предоставляет своим клиентам более качественные услуги при меньших затратах, чем приватизированная МТС, а также обеспечивает гораздо большие выгоды для людей. провинции за счет прибыли », — пишет экономист Тоби Сэнгер.«Несмотря на все это, правительство Саскачевана, возможно, закладывает основу для приватизации SaskTel. Если это то, чего мы можем ожидать от приватизации других коммунальных предприятий — более высокие сборы для населения, более низкое качество услуг, гораздо более высокая компенсация генеральным директорам и руководителям, более высокая корпоративная прибыль, но гораздо более низкая отдача для провинций — мы можем понять, почему Bay Стрит [канадская Уолл-стрит] так взволнована приватизацией Hydro One и тем, почему жители Онтарио должны быть очень обеспокоены.”

MTS; Новая страница поиска Microsoft

Советы по установке Microsoft Transaction Server
Читатель прислал несколько советов, которые он разработал в течение нескольких недель проб и ошибок на серверах и рабочих станциях, для установки Microsoft Transaction Server (MTS) из пакета Windows NT 4.0 Option Pack. Его группа определила, что MTS не установит или не обновит правильно, если выполняется одно из следующих условий:

• Если вы изначально устанавливали MTS поверх пакета обновления 3 (SP3) на диск, отличный от диска по умолчанию, C: \.
• Если вы изначально устанавливаете MTS поверх любого пакета обновления, кроме SP3.
• Если вы применяете обновления компонентов доступа к данным Microsoft (MDAC) не по порядку (например, 1.5, 2.1, 2.01, 2.2).

Корпорация Майкрософт выпустила два исправления MTS, Q195015_i386.exe и Q196021_i386.exe, которые устраняют первые две из этих неприятных проблем с установкой (для их получения необходимо обратиться в службу поддержки Microsoft). Проблема с пакетом услуг MDAC все еще остается проблемой; наш коллега-администратор рекомендует подтверждать версию MDAC в каждой точке паузы в сборке MTS.

Новая страница поиска Microsoft
Недавно я попробовал новую общую страницу поиска Microsoft и получил хорошие результаты даже при поиске непонятных деталей. Диалоговое окно поиска (http://search.microsoft.com/us/SearchMS.asp), второе поколение общей страницы поиска на веб-сайте Microsoft, представляет собой поле с двумя вкладками. Первая вкладка предлагает флажки для всех основных категорий информации — я обычно проверяю «ИТ-ресурсы» и «Поддержка и база знаний». Вторая вкладка (Поиск в результатах) появляется со списком совпадений после отправки запроса.Здесь вы можете ввести дополнительное ключевое слово или фразу для дальнейшего уточнения поиска.

Когда я искал «создать веб-папку», поисковая машина выдала 17 совпадений, почти все подходящие. Для сравнения я ввел ту же строку поиска на странице поиска TechNet (http://www.microsoft.com/technet/support/ search.htm? FR = 1) и получил 81 совпадение, большинство из которых нерелевантно. Поэтому в следующий раз, когда вы попытаетесь найти ответ, посмотрите, добьетесь ли вы лучших результатов с улучшенной общей страницей поиска, и дайте мне знать, как это происходит.

и Windows 9x
Согласно нескольким статьям службы поддержки Microsoft в Интернете, персональный веб-сервер Microsoft (PWS) может быть не совсем готов к работе в прайм-тайм. Вот список статей, которые могут оказаться полезными при устранении проблем с PWS. Учитывая наш коллективный опыт работы с Windows NT 4.0 Option Pack, этот список вряд ли обнадеживает.

, статья службы поддержки Майкрософт в Интернете Q158721 (http://support.microsoft.com/support/ kb / article / Q158 / 7/21.asp) содержит достаточно простые инструкции по установке и настройке HTTP и FTP на Windows 9x PWS. Хотя в статье не упоминается NT, я считаю, что вы также можете установить PWS на NT Workstation или Server. В статье также обсуждаются несколько вариантов аутентификации PWS.

PWS устанавливается в разные папки, в зависимости от того, используете ли вы дистрибутив CD-ROM или загружаемую версию. Статья службы поддержки Microsoft в Интернете Q158414 (http://support.microsoft.com/support/ kb / article / Q158 / 4/14.asp) документирует разницу в установке между двумя версиями.

Если вы устанавливаете PWS в системе, созданной из общей сетевой точки, установщик PWS не может найти четыре файла. Вы можете найти инструкции по копированию этих отсутствующих файлов в статье службы поддержки Microsoft Q173189 (http://support.microsoft.com/support/ kb / article / Q173 / 1 / 89.asp).

В некоторых случаях PWS не отображается в списке установленных приложений, что, конечно, означает, что вы не можете удалить его, нажав кнопку «Добавить / удалить» в апплете «Установка и удаление программ».Если вы столкнулись с этой проблемой, ознакомьтесь со статьей Q188681 службы поддержки Microsoft в Интернете (http://support.microsoft.com/support/ kb / article / Q188 / 6 / 81.asp), чтобы узнать, как вручную удалить ее из вашей системы.

Комментарий к дополнительному пакету опций
Теперь я понимаю, почему у меня не было времени, пытаясь установить работающую версию расширений Office Server: для расширений Office Server требуется Microsoft Transaction Server (MTS). Я установил Office Server Extensions и MTS поверх Service Pack 5 (SP5), и у меня не было готовых исправлений.Очевидно, что программное обеспечение Windows NT 4.0 Option Pack вышло из-под контроля. Нам не нужно мучиться в течение нескольких недель экспериментов, чтобы запустить прототип приложения. Те из нас, кто привержен платформе NT, страдают намного сверх разумного. Мы не планируем наши ИТ-бюджеты для поддержки тестирования и отладки программного обеспечения, которое должно быть готово к работе.

Если Microsoft ожидает, что мы примем эти продукты, ей придется гораздо лучше упаковывать каждое приложение NT Option Pack с последними обязательными обновлениями, включая множество исправлений проблемы 2000 года, которые вносятся через непредсказуемые, но частые интервалы.Если Microsoft планирует создавать дополнительные продукты, такие как Office Server Extensions, поверх приложений Option Pack, нам нужно быть абсолютно уверенными в каждом уровне в отношении установки и устранения неполадок. К сожалению, при текущем состоянии Option Pack у нас нет надежды достичь твердого состояния, необходимого для производственных систем, после трех или четырех слоев. Можете ли вы представить себе попытку заставить MTS, Index Server или другие продукты работать в Windows 2000 (Win2K)? Я точно не могу.

Я рекомендую группе NT Option Pack перекомпилировать каждое приложение с последними необходимыми обновлениями, тщательно тестировать каждую процедуру установки, полностью задокументировать все необходимые шаги по установке и настройке, четко определять зависимости порядка и тестировать каждое приложение отдельно и вместе со всеми остальными.После прохождения тщательного тестирования качества приложений команда NT Option Pack может упаковать каждый компонент отдельно для публичной загрузки и отправить обновленный дистрибутив MSDN на компакт-диске. Если Microsoft не предоставляет текущие протестированные сборки, зависимости для заказа и комплексные процедуры установки и настройки, я советую вам держаться подальше от всего этого набора программного обеспечения, включая Office Server Extensions.

ИТ-отделы сталкиваются с аналогичными проблемами упаковки каждый раз, когда обновляют корпоративную инфраструктуру.Я знаю — я работал над множеством инфраструктурных проектов, включая тот, который получил высшую награду Microsoft в этом году. Поэтому я считаю справедливым сравнить проблемы, связанные с развертыванием новой стандартной рабочей станции, с задачей Microsoft по созданию рабочего NT Option Pack. Успех требует тщательного тестирования и пристального внимания к деталям.

Часть каждого инфраструктурного проекта включает обновление рабочего стола. Поскольку настольные рабочие станции бывают разных видов, наши образы должны учитывать различия в оборудовании рабочих станций, что означает создание бесконечных версий базового образа и его тестирование на 10 или более материнских платах и ​​многих комбинациях внутренних компонентов и периферийных устройств.При развертывании по всему миру нам также необходимо создавать образы на нескольких языках. Когда у нас есть рабочая базовая линия, мы настраиваем изображение для поддержки многочисленных комбинаций видеокарт, сетевых адаптеров и периферийных устройств. Существуют два общих решения для управления этими различиями: базовый образ, который работает с определенной конфигурацией оборудования в сочетании со вторым этапом установки протестированных драйверов, или полная библиотека образов, организованная аппаратными компонентами рабочих станций, которые включают необходимые драйверы.Третье решение предполагает замену старых рабочих станций новым стандартным оборудованием, чтобы мы могли использовать один и тот же образ для большинства рабочих столов. И мы должны тщательно документировать каждую процедуру установки, чтобы обеспечить воспроизводимые результаты и надежность ИТ-специалистов.

Если бы ИТ-отделы последовали примеру Microsoft с пакетом NT Option Pack, каждый ИТ-директор в стране искал бы новую работу. Представьте себе развертывание рабочей станции, которая работает только часть времени и отвечает пользователям: «О, просто переустановите все свои приложения, и пока вы работаете, примените эти 16 исправлений, 27 исправлений ошибок и 9 исправлений проблемы 2000 года.И, кстати, у нас нет никаких подробных инструкций по установке или рекомендуемого порядка, в котором следует применять обновления ».

% PDF-1.4 % 188 0 объект > эндобдж xref 188 84 0000000016 00000 н. 0000002791 00000 н. 0000002893 00000 н. 0000003415 00000 н. 0000003714 00000 н. 0000003741 00000 н. 0000004289 00000 п. 0000004564 00000 н. 0000004676 00000 н. 0000004790 00000 н. 0000005262 00000 н. 0000005415 00000 н. 0000005589 00000 н. 0000005626 00000 н. 0000006326 00000 н. 0000007111 00000 н. 0000007198 00000 н. 0000007865 00000 н. 0000008150 00000 н. 0000008266 00000 н. 0000008303 00000 н. 0000010952 00000 п. 0000011135 00000 п. 0000011205 00000 п. 0000011476 00000 п. 0000013343 00000 п. 0000013372 00000 п. 0000013792 00000 п. 0000017561 00000 п. 0000017981 00000 п. 0000018401 00000 п. 0000018821 00000 п. 0000018992 00000 п. 0000024604 00000 п. 0000024718 00000 п. 0000024899 00000 п. 0000027330 00000 н. 0000029761 00000 п. 0000054601 00000 п. 0000088854 00000 п. 0000088929 00000 н. 0000089228 00000 п. 0000089303 00000 п. 0000089378 00000 п. 0000091136 00000 п. 0000091211 00000 п. 0000092984 00000 п. 0000093059 00000 п. 0000094833 00000 п. 0000094908 00000 н. 0000096687 00000 п. 0000131322 00000 н. 0000131397 00000 н. 0000131471 00000 н. 0000131973 00000 н. 0000132327 00000 н. 0000132350 00000 н. 0000132416 00000 н. 0000132533 00000 н. 0000132608 00000 н. 0000132682 00000 н. 0000133190 00000 п. 0000133547 00000 н. 0000133570 00000 н. 0000133636 00000 н. 0000133753 00000 н. 0000133828 00000 н. 0000133902 00000 н. 0000134412 00000 н. 0000134769 00000 н. 0000134792 00000 н. 0000134858 00000 н. 0000134975 00000 н. 0000135050 00000 н. 0000135124 00000 н. 0000135634 00000 п. 0000135990 00000 н. 0000136013 00000 н. 0000136079 00000 п. 0000136196 00000 п. 0000136646 00000 н. 0000175504 00000 н. 0000175620 00000 н. 0000001976 00000 н. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 271 0 объект > поток xb«b`c`g` ̀

Я клиент МТС, и мой счет скоро вырастет

Когда я прочитал новость о том, что Bell покупает МТС, у меня вздрогнул кошелек.

Мое начало работы с OpenMedia не могло быть более увлекательным. Этот месяц ознаменовал начало моей стажировки, и когда я покидал свою родную провинцию Манитоба, чтобы полюбоваться видом на океан Ванкувера, было объявлено о сделке Bell о покупке MTS. Я читал новости на своем смартфоне, который, кстати, работает на безлимитном тарифном плане МТС, и почувствовал, как содрогнулся мой кошелек.

Год студенческой жизни плохо сказался на моих финансах. Тем не менее, за последние полвека студенты университетов из Манитобы имели преимущество перед своими сверстниками из других провинций.В MTS я плачу почти половину того, что студент из Альберта заплатил бы за максимум данных в Bell. Например, сравните максимальное количество данных Bell и план местной телефонной связи за 150 долларов в месяц, который предлагает 15 ГБ данных, с безлимитным трафиком MTS и планом местной телефонной связи за 65 долларов в месяц. То же самое касается клиентов в Онтарио, Британской Колумбии и Приморья, которые также платят за беспроводные услуги (вы можете узнать больше об изменении цен в провинциях здесь).

Сейчас крайне неопределенное время, чтобы быть клиентом МТС.Поскольку Bell пытается получить контроль над значительной долей рынка оператора связи из Манитобы, я чувствую себя посередине. Меня беспокоит вероятность того, что мой счет за сотовый телефон резко вырастет, если Bell добьется успеха. Если стоимость моего плана будет увеличена до уровня предложений Bell по всей Канаде, это может означать, что я буду платить почти вдвое дороже, чем сейчас. Это удар, который клиенты не могут выдержать.

Сторонники сделки Белл-МТС утверждают, что низкая стоимость моего текущего счета связана с «неустойчивой ценовой конкуренцией».Другими словами, они с сомнением заявляют, что МТС искусственно занижала цены, чтобы опередить конкурентов, и в результате ни одна из вовлеченных компаний не могла получить приличную прибыль. Сделка основана на предположении, что МТС не зарабатывает достаточно денег для модернизации технологий и инфраструктуры в Манитобе, и что пятилетний план Bell в размере 1 миллиарда долларов станет решением.

Так Белл действительно здесь, чтобы вытащить Манитобу из каменного века? Что ж, факты говорят о другом.

Несмотря на то, что МТС является одним из самых доступных операторов связи в стране, прибыль даже выше, чем у Bell.Согласно международно признанному эксперту в области телекоммуникаций Дуэйну Винсеку:

Утверждения об искусственном поддержании конкуренции и низких цен в Манитобе противоречат реальности, согласно которой прибыль МТС очень высока, а не низка и намного выше, чем у BCE. Сам Bell отметил этот момент в своей презентации аналитикам, предположив, что показатели EBITDA МТС сопоставимы с ее собственными.

У них есть преимущество в капитальных вложениях Bell. А если вы внимательно посмотрите на предложения МТС в Интернете для частных лиц, они могут предложить базовое широкополосное подключение к Интернету со скоростью 5 Мбит / с 95% жителей Манитоба, что превосходит Bell в Атлантической Канаде.Они также активно внедряют покрытие 4G LTE для сильно разбросанных и сельских жителей Манитобы. Они стремятся охватить 90% жителей провинции в течение следующих 2 лет.

Заявка Bell не включает планы значительно превзойти цели, уже поставленные МТС. И это не совсем согласуется с утверждением о том, что Bell пересмотрит услуги, доступные жителям Манитоби. Если МТС зарабатывала достаточно прибыли, чтобы держать нас в курсе последних событий, то утверждение о том, что ставки были неприемлемо низкими, похоже, улетучится.Возможно, Bell просто надоело соответствовать ценам конкурентов.

Эта сделка приведет к удалению ключевого игрока на рынке, который удерживал мой счет на низком уровне. При сравнении по стране становится ясно, что низкие ставки МТС вынуждали его конкурентов последовать их примеру в Манитобе. В течение многих лет МТС играла решающую роль в поддержании такого разнообразия выбора на телекоммуникационном рынке Манитобы. Предлагаемое слияние выведет четвертого игрока из игры.

Аналогичное слияние было закрыто Евросоюзом именно по этой причине.Великобритания, как и Манитоба, имеет одни из самых доступных тарифных планов беспроводной связи в своей лиге; мы можем связать эти конкурентоспособные цены с ее рынком с четырьмя операторами связи, который был бы сокращен до трех, если бы слияние было успешным. Еще одна отличительная черта британского рынка — это наличие широкого круга доступных операторов мобильных виртуальных сетей (MVNO), таких как GiffGaff.

ЕС назвал эту попытку слияния несправедливой сделкой. Теперь пора Канаде сделать то же самое.

OpenMedia привлекла меня, потому что они борются за справедливость.Не кажется оправданным, что такие клиенты, как я, должны смотреть, как компании выкупают своих конкурентов, взимают с меня больше и не выполняют обещания по улучшению моих услуг.

Мы хотим, чтобы мы получали разумную цену за наши данные и доступ в Интернет. Он начинается с требования, чтобы Бюро по конкуренции, CRTC и Министерство инноваций, науки и экономического развития сделали все правильно и не допустили этого поглощения.

Бюро по конкуренции в настоящее время принимает отзывы о предлагаемом слиянии Белл и МТС.Сообщите им, что вы думаете. И если вы хотите глубже погрузиться в предысторию сделки, обязательно ознакомьтесь с этими очень информативными блогами друзей OpenMedia г-на Бена Класса (здесь) и профессора Дуэйна Винсека (здесь), оба из Карлтонского университета в Оттаве.

Обслуживание Интернета: работа с MTS, ASP и Visual Basic

• 25.10.2019
• Читать 12 минут

В этой статье

 
Dim oContext как ObjectContext
установить oContext = GetObjectContext ()
  

Затем вы можете сообщить МТС, что ваш код завершен и все в порядке:

 
oContext.SetComplete
  

Если ваш код обнаруживает какой-либо тип проблемы, вы также можете сообщить МТС, что он должен прервать транзакцию:

 
oContext.SetAbort
  

Большинство обсуждений МТС на этом заканчивается.Но давайте посмотрим, что на самом деле делают два метода Setxxx. Ни одно из этих утверждений не заставляет MTS выполнять действие. Вместо этого они просто помечают транзакцию как успешную или неуспешную до этого момента. На самом деле транзакция не завершается, пока не завершится корневой компонент (компонент, запустивший транзакцию).
MTS решает проблему создания экземпляра объекта с помощью двух функций, называемых активацией точно в срок (JIT) и деактивацией при первой возможности (ASAP).Активация JIT означает, что объекты, созданные в соответствии с требованиями клиента, загружаются в любой момент времени. Когда объект вызывает SetComplete, сервер знает, что объекту не нужно удерживать какие-либо данные о состоянии, и он деактивирует объект как можно скорее. Затем сервер может вернуть любые ресурсы, которые удерживал объект.
Таким образом, клиент может получить ссылку на ресурс и удерживать ее как можно дольше, сохраняя при этом ресурсы сервера. Когда клиент снова ссылается на какой-либо метод или ресурс в объекте, MTS воссоздает объект.Вновь созданный объект отличается от того, который клиент использовал последний раз, но MTS следит за тем, чтобы ссылка клиента все еще работала, чтобы клиент не заботился о том, что объект отличается.
Вы можете вызвать DisableCommit, чтобы приостановить фиксацию транзакции. Это позволяет вам убедиться, что транзакция не зафиксирована между вызовами метода к объекту. Любая попытка зафиксировать объект до вызова EnableCommit или SetComplete прервет транзакцию. EnableCommit уведомляет MTS, что, хотя работа, выполняемая методом, еще не завершена, вся работа, связанная с выполняющейся в данный момент транзакцией, может быть зафиксирована.Это позволяет МТС совершить транзакцию в нужное время.
Самого интересного метода МТС я еще не коснулся. Давайте обсудим, что происходит, когда вы создаете экземпляр объекта, который используется MTS. Когда клиентское приложение, такое как сценарий ASP, вызывает метод в объекте MTS, оно никогда напрямую не получает интерфейс к этому объекту MTS. MTS Executive обертывает каждый объект, а клиент получает интерфейс к оболочке контекста. После завершения вызова метода оболочка освободит все интерфейсы для объекта и уничтожит сам объект.Клиент никогда не знает, что теперь у него есть интерфейс для деактивированного объекта. В следующий раз, когда клиент вызовет метод объекта, оболочка создаст новый экземпляр компонента для выполнения запроса. Так работают функции JIT.
Это вызывает обсуждение, которое я провел на TechEd в прошлом году. Один из менеджеров программы COM + обсуждал, как COM + и MTS обрабатывают объекты. Он упомянул, что, поскольку MTS был встроен в Windows NT® 4.0, объекты MTS были своего рода второсортными гражданами COM.Вот почему вам нужно использовать метод CreateInstance для создания экземпляров COM-объектов в объекте MTS вместо использования CreateObject. CreateInstance позволяет новому объекту наследовать текущий объект контекста.
Если вновь созданный объект является объектом MTS, выполняемым в рамках транзакции, любой объект, созданный из объекта контекста компонента, будет автоматически включен в текущую транзакцию при двух условиях: создаваемый объект должен быть отмечен как «Поддерживает транзакции» или «Требует транзакции.»
Итак, когда вы создаете объект MTS в своем сценарии ASP, вы можете использовать CreateObject. Но когда этот объект создает другой объект, вы должны использовать CreateInstance.

 
Установите oBook = Context.CreateInstance ("Pubs.Book")
  

Это работает так же, как CreateObject, за исключением того, что Book теперь работает в том же контексте, что и объект, который его инициировал. Обратите внимание, что тот же менеджер программы указал, что CreateInstance будет работать в COM +, но в этом больше нет необходимости.
Другая проблема возникнет, когда вы попытаетесь передать указатель на объект MTS.Часто клиенту требуется ссылка на объект, созданный в результате вторичного вызова внутри метода. Поскольку MTS хранит контекстную информацию о каждом экземпляре активного объекта, он должен быть проинформирован о том, что ссылка возвращается клиенту.
Когда компонент хочет передать ссылку на себя клиенту или другому объекту, он всегда должен сначала вызывать SafeRef, а затем передавать ссылку, возвращаемую этим вызовом. SafeRef используется объектом для получения ссылки на себя, которую можно безопасно передать вне его контекста.Синтаксис выглядит так:

 
Установите safeobject = SafeRef (Me)
  

Из апрельского выпуска журнала MSDN за 2000 год.

Alp7 / TACC-Alp14 / TOG генерирует долгоживущие, быстрорастущие MT с помощью нетрадиционного механизма

Биология дрожжевых клеток

Штаммы S. pombe , перечисленные в дополнительной таблице S2, были любезным подарком от Такаши Тода (Cancer Research UK , Лондонский научно-исследовательский институт). Штаммы были получены из штаммов в ⁶ путем вставки слитых тубулинов GFP. Клетки S. pombe культивировали стандартными методами ³³ .Для визуализации клетки выращивали в заквасочных культурах среды YES при 25 ° C, затем разбавляли EMMG, 100 мкг мл ^-1 уридина, 100 мкг мл ^-1 лейцина и выращивали при встряхивании при 25 ° C до ранней логарифмической фазы. ~ 2 × 10 ⁶ клеток мл ^-1 . Время удвоения для каждой из популяций составляло ~ 9 часов для делеций alp7 или alp14 и ~ 5,5 часов для контрольных клеток.

Покадровая визуализация живых клеток

Аликвоты клеток в ранней логарифмической фазе помещали на подушку с агаром (2% (мас. / Об.) Агарозы в EMMG, 100 мкг / мл ^-1 уридина, 100 мкг мл ^{— 1} лейцин) на предметном стекле микроскопа.Сверху помещали покровное стекло и герметизировали VALAP (вазелин, ланолин, парафин в смеси 1: 1: 1). Предметные стекла инкубировали при 25 ° C или 35 ° C в течение> 1 часа перед визуализацией. Нагреваемый столик микроскопа использовался для поддержания температуры во время получения изображений с помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском: конфокальной системы визуализации PerkinElmer UltraVIEW VoX с дисковым блоком Yokagawa CSU-X1, камеры Hamamatsu ORCA-R2 и микроскопа Nikon ECLIPSE Ti, управляемого PerkinElmer Volocity v. 6.1 программное обеспечение. Изображения были захвачены при 0.1 кадр / с с использованием объектива 100 × 1,4NA и двухкратного объединения камеры, что дает эквивалентный размер пикселя 139 нм.

Клонирование Alp14 и Alp7

Гены, кодирующие Alp14, Dis1 и Alp7, амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК S. pombe дикого типа. ДНК, кодирующая Alp14 с C-концевой меткой 10 × Histidine, была клонирована в pIEx / Bac-NcoI => NdeI через NdeI и NotI. Alp14 с C-концевым AviTag был клонирован в pIEx / Bac-C-Avi через NdeI и NotI. Alp14 с N-концевым AviTag был клонирован в pIEx / Bac-N-Avi через NdeI и NotI.Alp7 с N-концевым AviTag был клонирован в pIEx / Bac-N-Avi через NdeI и NotI. Ген BirA-лигазы амплифицировали из вектора pET-17b и клонировали в вектор pIEx / Bac-NcoI => NdeI через NdeI и SacI, добавляя стоп-кодон перед His-меткой.

Экспрессия белка в клетках Sf9-насекомых с использованием бакуловирусной системы BacMagic (Novagen)

Белки экспрессировали в бакуловирусной системе с использованием клеток Sf9 насекомых. Клетки Sf9 инкубировали при 28 ° C со встряхиванием при 100–200 об / мин для размножения вируса и экспрессии белка.

Создание бакуловируса из плазмид pIEx / Bac

Векторов pIEx / Bac размножали в течение ночи в 100 мл культуры бактериальных клеток DH5 при 37 ° C и очищали с помощью набора EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen).

Тест на экспрессию и растворимость перед генерацией бакуловируса

Экспрессию и растворимость белков проверяли с помощью системы InsectDirect от Novagen, которая позволяет переводить белки непосредственно из вектора pIEx / Bac в соответствии с инструкциями производителя.Через 48 ч клетки Sf9 собирали и лизировали, как описано ниже для более крупных культур Sf9. Лизат центрифугировали до 20000 г. Осадок и супернатант тестировали вестерн-блоттингом на экспрессированные белки.

1-е поколение бакуловирусов

Первое поколение бакуловирусов было создано с использованием системы BacMagic от Novagen. Согласно протоколу производителя, смесь 1 мл среды Bac Vector Insect Cell Media (Novagen), 5 мкл реагента для трансфекции Insect GeneJuice (Novagen), 500 нг вектора pIEx / Bac и 100 нг ДНК BacMagic (Novagen) инкубировали в течение 15–15 дней. 30 мин при комнатной температуре.Затем смесь добавляли к 1 × 10 ⁶ клеток в чашке 35 мм после удаления исходной среды для клеток насекомых-векторов Bac. Клетки инкубировали при 28 ° C в увлажненном контейнере. Через 5 ч добавляли еще 1 мл среды для клеток насекомых-вектора Bac, чтобы избежать высыхания. Через 5 дней среду собирали и использовали в качестве бакуловируса первого поколения.

Амплификация бакуловируса

0,3 мл бакуловируса 1-го поколения (вирус P1) добавляли к 30 мл клеток Sf9 при 1,5 × 10 ⁶ клеток мл ^-1 в среде Bac Vector Insect Cell Media с добавлением 1.5% (об. / Об.) Эмбриональная бычья сыворотка (FBS) (Sigma), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг мл ^-1 стрептомиоцина (GIBCO / Invitrogen), встряхивание при 200 об / мин при 28 ° C в течение 3-5 дней . Когда клетки начали лизироваться и количество клеток уменьшилось, супернатант, содержащий вирус P2, собирали центрифугированием при 200 g в течение 5 минут. Для длительного хранения аликвоты объемом 1 мл замораживали, инкубируя сначала в течение 1 ч при 20 ° C, затем в течение 24 ч при -80 ° C перед хранением в жидком азоте. Рабочие исходные растворы бакуловируса Р3 для экспрессии получали путем 2-й амплификации вируса.0,3 мл вируса P2 добавляли к 30 мл суспензионной культуры 1 × 10 ⁶ клеток Sf9 мл ^-1 . Культуры инкубировали при 28 ° C при 200 об / мин в течение 3-5 дней. Когда клетки начали лизироваться, супернатант собирали после центрифугирования при 200 g и использовали в качестве вируса P3 для инфицирования более крупных культур клеток Sf9.

5 мл вируса P3 добавляли к 500 мл 1 × 10 ⁶ клеток Sf9 мл ^-1 и инкубировали в течение 54–64 ч при 28 ° C, встряхивая при 120 об / мин. Для совместной экспрессии BirA-лигазы и белков, меченных Avi, добавляли 4 мл вируса P3 целевого белка и 1 мл вируса BirA-лигазы P3, чтобы гарантировать биотинилирование Avi-tag.Клетки собирали центрифугированием при 100 g. Влажный осадок клеток взвешивали и затем лизировали в буфере для лизиса (50 мМ HEPES-буфер pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5% (об. / Об.) Глицерина, 0,1% (об. / Об.) Triton-X 100, с добавлением свежеприготовленной 1 мМ DTT (Sigma) и ингибиторы протеаз: 5 мкг мл ^-1 химостатина (Peptide International Inc., США / Канада), 0,5 мкг мл ^-1 лейпептина (Peptide International Inc., США / Канада), 10 мкг мл ^-1 антипаин (Peptide International Inc., США / Канада), 2 мкг мл ^-1 апротинин (Peptide International Inc., США / Канада), 0,7 мкг мл ^-1 пепстатина (Peptide International Inc., США / Канада), 10 мкМ E64 (Peptide International Inc., США / Канада), 10 мкг мл ^-1 PMSF (Sigma) ), используя 4 мл буфера для лизиса на 1 г влажного осадка. Лизаты клеток быстро замораживали путем погружения в жидкий азот. Затем лизат использовали для дальнейшей очистки или хранили при -80 ° C.

Очистка белка

Поскольку белки экспрессировались с разными аффинными метками, процедура очистки для каждой конструкции варьировалась.Замороженные лизаты размораживали на льду и центрифугировали при 20000 g в течение 40 мин при 4 ° C в роторе SS-34 (Sorvall). Затем супернатанты обрабатывали при 4 ° C. Alp14 и Alp7 и разные аффинные метки требовали разных условий для успешной очистки.

Очистка Alp14 с помощью His-tag

Для очистки His-меченых белков без GFP-метки 50 мл осветленного надосадочного раствора лизиса загружали при 5 мл мин. ^-1 на 5 мл колонку HiTrap SP HP ( GE Healthcare), уравновешенный катионообменным буфером с низким содержанием соли (150 мМ NaCl, 6.7 мМ HEPES pH 7,5, 6,7 мМ MES, 6,7 мМ Na-ацетат). Колонку последовательно промывали ~ 25 мл низкосолевого катионообменного буфера, а затем ~ 25 мл катионообменного буфера, содержащего 250 мМ NaCl. Для элюирования использовался непрерывный градиент от 150 мМ NaCl до 1000 мМ NaCl в катионообменном буфере. Alp14 начинал элюировать начиная с 300 мМ NaCl. Аликвоты проверяли с помощью SDS-PAGE, фракции пиков объединяли, имидазол добавляли до 10 мМ, затем связывали с колонкой HisTrap HP объемом 1 мл, предварительно уравновешенной буфером с низким содержанием имидазола (50 мМ NaPO ₄ pH 8.0, 300 мМ NaCl, 15 мМ имидазол, 10% глицерин). Колонку последовательно промывали имидазольным буфером (50 мМ NaPO ₄ pH 8,0, 100 мМ NaCl, имидазол, 10% глицерин), содержащим 30, 60, 80 мМ имидазол, а затем элюировали буфером, содержащим 500 мМ имидазол. Фракции Alp14 объединяли и загружали в колонку HiTrap Q HP (GE Healthcare) объемом 1 мл, уравновешенную 10 мМ бис-трис-пропаном, pH 8,0, 10 мМ трис-HCl, 10% глицерином, затем элюировали с использованием градиента 100-1000 мМ NaCl. Фракции, содержащие Alp14, объединяли, разделяли на 3-4 аликвоты по 20 мкл, содержащие ~ 4 мкМ Alp14, и быстро замораживали в жидком азоте.

Очистка Alp14-GFP

Для очистки Alp14-GFP 10-20 мл очищенного лизата загружали в 1,2 мл колонку SP Sepharose HP (GE Healthcare), уравновешенную катионообменным буфером с низким содержанием соли. Смолу промывали 7,5 мл катионообменного буфера с низким содержанием соли и 10 мл 250 мМ NaCl в катионообменном буфере. Белки элюировали 10 мл 500 мМ NaCl в катионообменном буфере. Фракции, содержащие целевой белок, объединяли и загружали на 500 мкл смолы Ni-NTA Superflow (Qiagen), уравновешенной буфером с низким содержанием имидазола.Смолу промывали 10 мл буфера с низким содержанием имидазола, затем имидазольным буфером, содержащим 30 и 60 мМ имидазольного буфера, перед элюированием 500 мМ имидазоловым буфером. Пиковые фракции, содержащие Alp14, объединяли, разделяли на аликвоты, быстро замораживали и хранили в жидком азоте.

Очистка белков AviTag

Белки, меченные Avi, очищали путем нанесения 15–20 мл надосадочного лизата на 600–800 мкл мономерной авидиновой агарозы (Thermo Scientific) гравитационной колонки, уравновешенной 100 мМ NaPO ₄ , pH 7.2 и 150 мМ NaCl. Смолу промывали 10 мл (100 мМ NaPO ₄ pH 7,2 и 150 мМ NaCl) и 10 мл (100 мМ NaPO ₄ pH 7,2 и 450 мМ NaCl). Без второй промывки при концентрации 450 мМ NaCl тубулин клеток насекомых очищали совместно с Alp14. Белки сначала элюировали 10 мл буфера для элюирования (100 мМ NaPO ₄ pH 7,2, 150 мМ NaCl и 7,5 мМ биотина), затем 3 мл буфера для элюирования, содержащего 2 М мочевины, и собирали фракции по 500 мкл. Пиковые фракции без мочевины были дополнены 10% глицерином и аликвотами по 20 или 50 мкл, замороженными и хранящимися в жидком азоте.Пиковые фракции, содержащие 2 М мочевины, подвергали диализу против 100 мМ NaPO ₄ pH 7,2, 150 мМ NaCl и 10% глицерина в диализной кассете Slide-A-Lyzer 7K MWCO (ThermoScientific) в соответствии с инструкциями производителя. Затем диализованные белки разделяли на аликвоты, быстро замораживали и хранили в жидком азоте.

Очистка тубулинов

Тубулины S. pombe получали в соответствии с ³⁴ из штаммов дикого типа, содержащих двойную изоформу α1β + α2β, или из штамма с одной изоформой (mmsp174), экспрессирующего α1β тубулин ³⁵ .Тубулин головного мозга свиньи получали, как описано в ³⁶ , обессоливали в PEM плюс 20 мкМ GDP и хранили в жидком азоте. Концентрации тубулина были измерены в 6 M GdHCl с использованием коэффициентов экстинкции 105 838 M ^-1 см ^-1 (мозг свиньи) и 108 390 M ^-1 см ^-1 ( S. pombe ), рассчитанных в соответствии с на номер ³⁷ . Тубулин, способный к полимеризации, оценивали путем полимеризации тубулина при 25 ° C в течение 90 мин в PEM, 1 мМ DTT, 1 мМ GMPCPP.МТ осаждали в роторе TLA100 (Beckman Coulter) при 45000 об / мин (

г), 25 ° C в течение 5 мин. Образцы SN и осадка анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания Sypro Red (Invitrogen). Долю функционального полимеризованного тубулина в осадке определяли с использованием лазерного гелевого сканера Pharos и программного обеспечения Quantity one (Bio-Rad) как 86,6% отдельной изоформы и 88,9% тубулина дикого типа.

Анализы динамики микротрубочек

GMPCPP-стабилизированные семена MT головного мозга свиньи, меченные Alexa488, были созданы с использованием 5 мкМ тубулина головного мозга свиньи (10% меченого сукцинимидилового эфира Alexa Fluor 488 (A-20000, Molecular Probes)) в 1 мМ GMPCPP, 1 мМ MgCl ₂ , PEM100, инкубировали на льду в течение 5 минут для обмена GTP и GMPCPP, затем полимеризовали при 37 ° C в течение 45 минут.Микротрубочки центрифугировали в Airfuge (Beckman Coulter) в течение 5 минут при 25 фунт / кв. Дюйм при комнатной температуре и осадок микротрубочек осторожно ресуспендировали в 50 мкл теплого PEM100. Проточные камеры были приготовлены с использованием полосок двойной липкой ленты шириной ~ 3 мм, расположенных на расстоянии ~ 6 мм друг от друга на силанизированном предметном стекле. Приклеиванием покровного силанизированного стекла (22 мм × 22 мм) сформировано 3 канала. Все стандартные растворы, такие как буфер PEM100, глюкозооксидаза, каталаза и глюкоза, осветляли центрифугированием в роторе TLA 100.3 (Beckman Coulter) при 50 000 × g в течение 30 мин.

Alp14 и Alp7 заменяли буфером на PEM-буфер с помощью спин-колонок (ZebaSpin Desalting Columns, Micro (75 мкл), 40 K MWCO) перед каждой серией экспериментов. Концентрации Alp14 и Alp7 в образцах с замененным буфером и центрифугированием измеряли после экспериментов с помощью денситометрии гелей SDS-PAGE, окрашенных SyproRed (Cytoskeleton Inc.). Готовили маточную смесь, содержащую 1 мМ GTP, 38 ед. Мл ^-1 глюкозооксидазы, 8 нг мл ^-1 каталазы, 1% (об. / Об.) Β-меркаптоэтанола, 4.5 мг / мл глюкозы ^-1 в буфере PEM100. Растворы, включая повторно забуференный Alp14, Alp7, реакционную смесь и разбавленное антитело против Alexa Fluor 488 (A-11094, Molecular Probes), очищали центрифугированием в течение 5 минут при 20 800 g при 4 ° C непосредственно перед каждым экспериментом. Реакционную смесь готовили путем добавления 3 мкл тубулина S. pombe и 3–6 мкл белка с замененным буфером к основной смеси плюс буфер до общего объема 20 мкл. Проточные камеры кондиционировали следующим образом. С помощью вакуумного насоса и затем бумаги Whatman (Grade 1, Whatman) 50 мкл PBS было пропущено через канал для гидратации канала.15 мкл 0,1 мг / мл антитела ^-1 Anti-Alexa Fluor 488 (A-11094, Molecular Probes) в PBS-буфере пропускали в камеру и инкубировали в течение 5 мин. Канал промывали 40 мкл буфера PEM100. Затем поверхность блокировали 20 мкл 1% (об. / Об.) Tween-20 в течение 30 мин. Затем канал промывали 80 мкл PEM100. 15-20 мкл 1: 200 разведенных GMP-CPP-стабилизированных семян микротрубочек, меченных Alexa488, вводили в канал и инкубировали в течение 5 мин. Канал снова промывали 40 мкл PEM100.Наконец, в канал промывали 20 мкл свежеприготовленной реакционной смеси. Канал герметизировали VALAP (вазелин, ланолин, парафин в смеси 1: 1: 1) и визуализацию начинали в течение 20 минут.

Микроскопия в темном поле

Динамика микротрубочек отображалась, как описано в ³⁸ , с использованием микроскопа Nikon E800, оснащенного масляной радужной оболочкой Plan Fluor 100 × / 0,5–1,3 (Nikon) и масляным конденсатором темного поля (Nikon). Темнопольное освещение динамических немаркированных микротрубочек S. pombe создавалось ртутной дуговой лампой (HBO100 / W2, Zeiss) с использованием волоконно-оптического скремблера (Technical Video Ltd.), чтобы обеспечить равномерное освещение конденсатора. Для защиты образца от световых повреждений, в том числе УФ-излучения, использовался зеленый интерференционный фильтр (Nikon). При эпифлуоресценции семена Alexa Fluor 488 возбуждали ртутной дуговой лампой (система X-Cite exacte, Lumen Dynamics) через фильтр возбуждения HQ470 / 40 × (Semrock) и дихроичное зеркало Q495LP (Chroma Technology). При съемке использовался эмиссионный фильтр HQ525 / 50 м (Semrock). Ставни перед источниками света позволяли переключаться с темного поля на эпифлуоресценцию, управляемую контроллером MAC5000 (LUDL electronic products Ltd.). Изображения в темном поле снимались каждые 1 с при времени экспозиции 100 мс, в то время как изображения эпифлуоресценции снимались каждые 60 с при времени экспозиции 200 мс. Видео снимались длительностью 10–20 мин. Изображения были получены с помощью камеры Andor iXON + DU-897E EMCCD (Andor Technology), охлажденной до -80 ° C. Системой управляли с помощью программного обеспечения для визуализации Metamorph (Molecular Devices Inc). Для поддержания температуры микроскопа 25 ° C изолированный ящик вокруг микроскопа нагревали с помощью системы AirTherm ATX (World Precision Instrument, Inc.

ДИК-микроскопия и анализ динамики немеченых МТ

Анализы динамики МТ ²⁷ немеченых тубулинов S. pombe дикого типа и одиночных изоформ с использованием микроскопии VE-DIC для изображения МТ, образованных фрагментами аксонем, были выполнены и проанализированы как описан в ³⁸ , за исключением того, что анализы проводились в буфере PEM, 1 мМ DTT, 1 мМ GTP при 25 ° C.